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椪柑枯水应答基因表达研究

作　者: 杨明
导　师: 王日葵
学　校: 西南大学
专　业: 果树学
关键词: 椪柑抑制性差减杂交枯水表达序列标签差减文库聚类分析
分类号: S666
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

枯水(Section-drying)是柑橘贮藏过程中普遍发生的生理病害。果实发病后,果肉水分减少,风味变淡,果实重量明显降低,从而严重影响柑橘产业的经济效益。本试验以椪柑为试材,构建椪柑枯水相关基因的抑制差减杂交cDNA文库,通过对文库的筛选、克隆测序、功能分析以及实时定量RT-PCR验证,获得了椪柑枯水应答基因,这些基因反映了果实对枯水的调控情况,可作为今后防治枯水病害的候选基因。利用抑制性差减杂交技术以椪柑正常果肉cDNA作为对照组(Driver),以枯水果肉cDNA作为实验组(Tester),成功构建了一个正向差减文库,挑选了300个有效克隆进行测序分析,260个测序成功。BLASTx比对分析发现,获得的260条表达序列标签(ESTs)中有63条ESTs同源性较低或没有同源性,有197条ESTs找到了分属于52个功能己知基因的同源序列。这些差异表达基因主要涉及衰老、抗逆防御、几丁质和细胞壁代谢、蛋白降解等过程。以β-actin基因作为内参基因,对文库中编码β-微管蛋白、衰老相关蛋白、细胞色素c、半胱氨酸蛋白酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、转运蛋白、天冬氨酸蛋白酶前体、WRKY转录因子21的基因进行实时定量RT-PCR验证,结果发现：这8个基因均有明显的上调表达。其中编码β-微管蛋白与衰老相关蛋白的基因上调表达8倍左右；编码细胞色素c、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的基因上调表达5倍多；编码半胱氨酸蛋白酶.转运蛋白的基因上调表达2倍左右；而编码天冬氨酸蛋白酶前体、转录因子21的基因表达量均有极明显的上升,分别上升了350倍和120倍。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-9
第一章文献综述  9-17
  1.1 概述  9
    1.1.1 柑橘产业概况  9
    1.1.2 营养与经济价值  9
  1.2 柑橘枯水及研究进展  9-13
    1.2.1 枯水的概念  9
    1.2.2 柑橘枯水机理研究进展  9-13
    1.2.3 柑橘枯水机理研究的不足与亟待解决的问题  13
  1.3 抑制性差减杂交(SSH)技术及其在柑橘上的应用  13-17
    1.3.1 SSH技术概述  13
    1.3.2 SSH技术的基本原理  13
    1.3.3 SSH技术操作流程  13-14
    1.3.4 SSH技术评价  14
    1.3.5 SSH技术在柑橘中的应用  14-15
    1.3.6 SSH结合基因芯片技术的研究  15-17
第二章引言  17-20
  2.1 研究背景  17
  2.2 研究的目的与意义  17-18
  2.3 主要研究内容  18-19
  2.4 主要技术路线  19-20
第三章材料和方法  20-27
  3.1 试验材料  20-22
    3.1.1 材料处理  20
    3.1.2 主要仪器  20-21
    3.1.3 试剂  21-22
  3.2 试验方法  22-27
    3.2.1 总RNA的提取与mRNA的纯化  22
    3.2.2 SSH文库构建  22-25
    3.2.3 荧光定量RT-PCR分析  25-27
第四章结果与分析  27-35
  4.1 RNA提取及mRNA纯化结果  27-28
  4.2 cDNA文库构建结果  28-29
    4.2.1 反转录及RsaI消化  28
    4.2.2 抑制性差减杂交  28
    4.2.3 连接与转化  28-29
    4.2.4 SSH文库的筛选  29
  4.3 cDNA差减效率检测  29-30
  4.4 序列分析结果  30-33
    4.4.1 蛋白质功能分析  30-32
    4.4.2 Blast2Go聚类分析结果  32-33
  4.5 实时定量RT-PCR结果  33-35
第五章讨论  35-37
第六章结论  37-38
参考文献  38-42
致谢  42-43
附录Ⅰ缩略词表  43-44
附录Ⅱ 发表文章  44-45
附录Ⅲ 参研的项目  45

椪柑枯水应答基因表达研究

内容摘要

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