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柿果实木葡聚糖内糖基转移/水解酶基因的克隆及表达分析

作　者: 祝庆刚
导　师: 饶景萍
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 果树学
关键词: 柿果实软化木葡聚糖内糖基转移/水解酶实时荧光定量PCR
分类号: S665.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

柿（Diospyros kaki L.）果实采后极易软化，木葡聚糖是细胞壁的主要半纤维素多糖，对细胞壁的膨胀起限制作用。为探索木葡聚糖内糖基转移/水解酶（XTH）在柿果实采后软化过程中的分子调控机制，本研究以‘富平尖柿’（Diospyros Kaki L.cv.FupingJianshi）为试材，利用RT-PCR和RACE技术从果实不同发育时期分别提取总RNA，扩增得到4个XTH基因的cDNA全长序列，并研究丙烯、GA3和1-MCP处理对柿果实采后软化以及XTH基因表达的影响。主要结果如下：1.分别以柿成熟期和转色期果实提取的总RNA为模板，利用RT-PCR结合RACE技术克隆得到4个XTH基因cDNA全长序列：成熟期DkXTH1(1082bp, GenBank登录号JN605344)和DkXTH2(1243bp, GenBank登录号JN605345)；转色期DkXTH3(1244bp, GenBank登录号JN605346)和DkXTH4(1059bp, GenBank登录号JN605347)。通过NCBI中的Blastn比对结果表明，柿果实XTH基因序列与已登录的其它物种的XTH基因序列有较高的相似性。四个推导的氨基酸序列均包含XTH的酶活性催化位点:DEIDFEFLG，和在催化位点后的一个N-糖基化作用位点（N-X-S/T），同时在C-末端包含两对半胱氨酸序列。2.对获得的柿果实XTH基因进行实时荧光定量PCR分析显示：在柿果实成熟软化过程中，4个XTH基因表现出不同的表达方式。成熟期克隆得到的DkXTH1和DkXTH2在对照和丙烯处理果实中表达量较高，转色期克隆得到的DkXTH3和DkXTH4在柿果实成熟软化过程中也有表达，但表达量明显偏低。因此，XTH基因在柿果实成熟软化过程中可能起着一定的促进作用。而且DkXTH1和DkXTH2表达高峰分别在果实成熟的初期和中期，说明DkXTH1和DkXTH2分别与采后柿果实初期和中后期的软化关系密切。3.与对照相比，丙烯处理乙烯释放高峰升高且提前，而相应的XTH基因表达量也相对较高；而GA3处理和1-MCP处理的柿果实，乙烯释放量明显降低且其高峰推迟，XTH基因的表达量显著低于对照。 GA3处理和1-MCP处理能抑制XTH基因的表达，而丙烯能促进XTH基因的表达，表明柿果实中XTH基因的表达受乙烯调控。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
第一章文献综述  10-18
  1.1 果实成熟软化过程中细胞壁结构以及物质的变化  10-11
  1.2 相关代谢酶对果实采后成熟软化的作用  11-12
  1.3 柿果实采后软化研究进展  12-13
    1.3.1 酶与柿果实成熟软化的关系  12-13
    1.3.2 化学试剂在柿果实保鲜上的应用  13
      1.3.2.1 1-MCP  13
      1.3.2.2 赤霉素  13
  1.4 XTH 基因研究进展  13-17
    1.4.1 XTH 的作用特点  13-14
    1.4.2 XTH 在植物中的作用  14-17
      1.4.2.1 XTH 与果实成熟软化的关系  14-15
      1.4.2.2 XTH 与植物组织延伸生长的关系  15-16
      1.4.2.3 XTH 与乙烯的关系  16-17
      1.4.2.4 XTH 的其他生理作用  17
  1.5 本研究的目的与意义  17-18
第二章材料与方法  18-24
  2.1 材料  18
    2.1.1 果实材料  18
    2.1.2 试剂与药品  18
    2.1.3 仪器与设备  18
  2.2 试验方法  18-24
    2.2.1 试验处理  18
    2.2.2 生理指标测定  18-19
    2.2.3 柿果实总 RNA 提取与检测  19
    2.2.4 cDNA 第一链的合成  19
    2.2.5 RT-PCR 扩增 XTH 基因片段  19-20
    2.2.6 PCR 产物回收纯化  20
    2.2.7 cDNA 克隆  20
    2.2.8 挑菌落、摇菌和重组质粒分析鉴定  20-21
    2.2.9 cDNA 测序与序列分析  21
    2.2.10 3’RACE 和 5’RACE 反应  21
    2.2.11 XTH 基因全长序列的获得和分析  21-22
    2.2.12 实时荧光定量分析  22
    2.2.13 数据分析方法  22-24
第三章结果与分析  24-33
  3.1 柿果实总 RNA 的提取  24
  3.2 RT-PCR 扩增柿果实 XTH cDNA 片段  24-25
  3.3 3’RACE 和 5’RACE 扩增结果  25
  3.4 柿果实 XTH 基因 cDNA 全长扩增  25-26
  3.5 XTH 基因的生物信息学分析  26-29
    3.5.1 核苷酸序列比对分析  26-27
    3.5.2 柿果实 XTH 基因推导的氨基酸序列分析  27-29
    3.5.3 柿果实 XTH 基因氨基酸序列系统进化分析  29
  3.6 丙烯、1-MCP 和 GA3处理对柿果实硬度和乙烯释放速率的影响  29-30
  3.7 丙烯、GA3和 1-MCP 处理对柿果实 XTH 基因表达的影响  30-33
第四章讨论  33-35
  4.1 丙烯、GA3和 1-MCP 处理对柿果实采后软化及 XTH 基因表达的影响  33
  4.2 XTH 基因克隆及其表达在柿果实成熟软化过程中的作用  33-35
第五章结论  35-36
参考文献  36-42
缩略词  42-43
致谢  43-44
作者简介  44

柿果实木葡聚糖内糖基转移/水解酶基因的克隆及表达分析

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