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锥栗自然居群及农家品种遗传多样性的ISSR分析

作　者: 刘国彬
导　师: 罗正荣; 龚榜初
学　校: 华中农业大学
专　业: 果树学
关键词: 锥栗居群农家品种 ISSR 遗传多样性
分类号: S664.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

锥栗（Castanea henryi Rehd.et Wils.）是壳斗科（Fagaceae）栗属（Castanea Mill.）植物,为我国特有。锥栗是一种集食用、材用为一身的经济树种,风味明显优于板栗,又是优良的建筑用材,同时锥栗也是世界栗属植物品种改良的天然基因库。但目前,我国学者还没有对野生锥栗做过系统的资源调查,对我国野生锥栗资源现状、遗传多样性水平及遗传变异格局等方面的研究报道较少。本研究运用ISSR分子标记技术,以锥栗分布区内的16个居群449个野生锥栗个体为研究对象,在物种和居群水平上对锥栗居群遗传多样性及遗传结构进行ISSR分析;同时,还对部分农家品种进行了鉴定和遗传多样性研究。主要试验结果如下:1以锥栗叶片DNA为模板,对影响锥栗ISSR-PCR扩增效果的因素进行筛选和优化,建立了适用于野生锥栗的ISSR-PCR分析体系:25μL反应体系中,10×buffer2.5μL,模板DNA用量40或50ng,Mg²⁺ 1.5mmol/L,dNTPs 0.2mmol/L,引物0.3μmol/L,Taq DNA聚合酶用量1.0U,最后加无菌水至25μL。PCR扩增程序:94℃预变性3min;然后94℃变性45s,44℃—59℃（根据引物而定）退火45s,72℃2min,32个循环;最后72℃充分延伸5min,4℃终止反应。2从60条ISSR引物中筛选出20条扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物用于ISSR-PCR反应;449份野生锥栗试材共扩增出379条DNA谱带,其中多态性带378条,占99.74%;Nei’s基因多样度（即平均期望杂合度He）为0.2950,Shannon信息指数（Ⅰ）为0.4522;居群多态位点百分率在36.94%—53.30%之间,平均为46.09%;Nei’s基因多样度（He）在0.1202—0.1861之间,平均为0.1573;Shannon信息指数（Ⅰ）在0.1817—0.2781之间,平均为0.2357;AMOVA分析表明,居群间变异占47.49%,居群内变异占52.51%。结果表明:（1）供试锥栗具有较高的遗传多样性水平,居群间遗传分化较大,生境隔离和片段化、基因流受阻和遗传漂变可能是造成居群间遗传分化较大的原因;（2）不同居群遗传多样性不同,其中以湘西居群、靖州居群的遗传多样性水平较高,南平、资源居群较低。依据ISSR标记数据,对野生锥栗居群进行UPGMA聚类分析,结果表明,449份单株按各自居群聚在了一起。3利用筛选出的13条引物,对锥栗37个农家品种进行遗传多样性及亲缘关系分析。结果显示:（1）13条引物可区分37份农家品种及其优株;（2）供试农家品种的观测等位基因数1.8269,有效等位基因数1.5097,Nei’s基因多样度（He）为0.2923,Shannon信息指数为0.4344;（3）每条引物的扩增谱带从9条（引物828）—16条（引物821）不等,共扩增出156条谱带,平均每个引物产生12个ISSR片段,其中多态性带129条（占82.69%,每个引物产生9.9条多态性条带）。说明锥栗品种具有丰富的遗传多样性水平。4根据资源调查情况及遗传多样性和遗传变异分析结果,对我国锥栗资源利用和保护提出了三点建议。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略语表  11-12
第一章前言  12-24
  1.1 课题的提出  12
  1.2 遗传多样性的概念及其检测方法  12-13
    1.2.1 遗传多样性的概念及研究意义  12-13
    1.2.2 遗传多样性的检测方法  13
  1.3 ISSR原理、技术及其在植物中的应用  13-17
    1.3.1 ISSR原理及技术  13-14
    1.3.2 ISSR在植物中的应用  14-17
      1.3.2.1 种质资源鉴定  14-15
      1.3.2.2 亲缘关系重建  15
      1.3.2.3 遗传多样性检测  15
      1.3.2.4 遗传连锁图谱构建  15-16
      1.3.2.5 其他  16-17
  1.4 遗传多样性取样策略及栗属植物遗传多样性研究进展  17-22
    1.4.1 遗传多样性取样策略  17
    1.4.2 栗属植物系统学研究进展  17-18
    1.4.3 栗属植物遗传多样性研究进展  18-21
      1.4.3.1 栗属遗传多样性的形态学研究  18
      1.4.3.2 栗属遗传多样性的同工酶研究  18-19
      1.4.3.3 栗属遗传多样性的分子技术研究  19-21
    1.4.4 锥栗研究进展  21-22
  1.5 锥栗遗传多样性研究存在的问题  22-23
  1.6 本研究内容及目的  23-24
    1.6.1 研究内容  23
    1.6.2 研究目的  23-24
第二章锥栗基因组提取及ISSR-PCR反应体系的建立  24-31
  2.1 前言  24
  2.2 材料与方法  24-27
    2.2.1 试材与试剂  24-25
      2.2.1.1 试材  24
      2.2.1.2 试剂  24-25
    2.2.2 实验方法  25-27
      2.2.2.1 锥栗基因组DNA提取  25
      2.2.2.2 锥栗基因组DNA浓度、纯度及质量检测  25-26
      2.2.2.3 PCR体系优化方案  26-27
      2.2.2.4 扩增产物检测  27
  2.3 结果与分析  27-30
    2.3.1 不同材料DNA质量检测  27
    2.3.2 锥栗ISSR-PCR反应体系优化  27-30
      2.3.2.1 模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响  27-28
      2.3.2.2 Mg~(2+)浓度对ISSR反应的影响  28
      2.3.2.3 dNTP浓度对ISSR反应的影响  28
      2.3.2.4 引物浓度对ISSR反应的影响  28-29
      2.3.2.5 Taq酶对ISSR反应的影响  29
      2.3.2.6 退火温度对ISSR反应的影响  29-30
  2.4 讨论  30-31
    2.4.1 不同组织DNA的提取  30
    2.4.2 ISSR反应体系的建立  30-31
第三章锥栗居群遗传多样性的ISSR分析  31-42
  3.1 前言  31
  3.2 材料与方法  31-34
    3.2.1 实验试剂与仪器  31-32
      3.2.1.1 试剂  31-32
      3.2.1.2 仪器  32
    3.2.2 材料  32-33
    3.2.3 野生锥栗单株基因组DNA的提取与检测  33
    3.2.4 PCR反应及电泳  33-34
    3.2.5 数据收集与分析  34
  3.3 结果与分析  34-41
    3.3.1 基因组DNA的提取与检测  34-35
    3.3.2 引物筛选及锥栗的多态位点百分率  35-36
    3.3.3 野生锥栗的遗传多样性  36
    3.3.4 物种和居群水平的遗传多样性  36-37
    3.3.5 居群遗传结构的ISSR分析  37-38
    3.3.6 居群遗传分化程度的比较分析  38
    3.3.7 锥栗不同居群的遗传距离及聚类分析  38-41
  3.4 讨论  41-42
第四章锥栗农家品种的ISSR分析  42-48
  4.1 前言  42
  4.2 材料与方法  42-44
    4.2.1 材料  42-43
    4.2.2 试剂  43
    4.2.3 PCR反应及电泳  43
    4.2.4 数据分析  43-44
  4.3 结果与分析  44-46
    4.3.1 锥栗品种DNA扩增结果  44
    4.3.2 ISSR特异性标记  44-45
    4.3.3 锥栗品种的聚类分析  45-46
  4.4 讨论  46-48
第五章总讨论  48-54
  5.1 DNA提取技术的选择和改进  48
  5.2 ISSR体系的建立及其可行性  48-49
  5.3 锥栗居群的遗传多样性  49
  5.4 锥栗居群的遗传分化  49-51
  5.5 锥栗资源的保护  51-54
参考文献  54-62
致谢  62-63
附录  63-65
攻读硕士学位期间发表论文  65

锥栗自然居群及农家品种遗传多样性的ISSR分析

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