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大豆根瘤菌耐旱菌株的筛选及其蛋白组学研究

作　者: 裴晓峰
导　师: 朱宝成; 李俊
学　校: 河北农业大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 根瘤菌生物固氮耐旱性蛋白质组学
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本文以从黄淮海大豆产区分离得到的19株大豆根瘤菌和2株参比菌株作为供试菌株,采用实验室干旱胁迫初筛和土壤盆栽干旱胁迫复筛相结合的方法,通过比较供试根瘤菌株的生长能力、结瘤能力、固氮能力,从中筛选出在干旱条件下能够结瘤固氮的优良菌株;同时研究了干旱胁迫条件下接种根瘤菌对大豆植株生理生化指标的影响;选取耐旱优良菌株进行了蛋白质组学初步分析,以探寻其耐旱的机理。本研究结果为干旱条件下筛选大豆根瘤菌优良菌株提供一定的依据,并将促进干旱大豆产区根瘤菌的接种应用,发挥共生固氮功效。论文结果如下:用聚乙二醇(PEG)6000模拟干旱胁迫条件,随着干旱程度的增加,对供试菌株生长的抑制作用逐渐增大。当PEG6000浓度为25%时,有17菌株的OD值下降率在70%以上,说明干旱条件达到该水平时,菌株的生长开始受到严重的抑制。在同一PEG6000浓度条件下,菌株间OD值下降率存在较大差异,其中菌株B. japonicum USDA110、B. japonicum 4788、B. japonicum 4792、B. japonicum 4534、S. fredii 4632、S. fredii 4780、S. fredii 4796的OD值下降率明显低于其它菌株,说明这7株菌能够耐受不同程度的干旱,选作下一步土壤盆栽干旱试验复筛材料。复筛试验表明,随干旱程度增加,各株菌间在结瘤固氮方面存在差异。其中菌株B. japonicum 4788、B. japonicum 4792和B. japonicum USDA110具有在干旱条件结瘤固氮、促进植株生长的能力,因此这3株菌为筛选获得的优良耐旱菌株。用试剂盒的方法测定接种根瘤菌B. japonicum 4792的大豆植株叶片中的生理生化指标。结果显示,与对照相比,接种根瘤菌的大豆叶片中甜菜碱、SOD酶和叶绿素的含量都有不同程度的增加,丙二醛的含量则减少,说明接种根瘤菌能够提高大豆植株耐旱性物质的积累,使干旱危害得到缓解。采用蛋白质组学的方法,对干旱条件(PEG6000处理)下根瘤菌B. japonicum 4792的蛋白表达进行了分析。结果显示,与对照相比,菌株B. japonicum 4792经PEG6000处理后表达蛋白有10个蛋白发生上调,38个蛋白发生下调。通过MOLDI-TOF质谱鉴定差异表达蛋白,确定了12个差异蛋白,主要是与胁迫直接相关的应激蛋白,参与蛋白翻译协同因子,参与代谢途径和信号传导等有关的蛋白。在12个差异蛋白中,S-腺苷甲硫氨酸合成酶、应激蛋白和DNA结合应激反应蛋白以及ATP合成酶β亚基上调。其中S-腺苷甲硫氨酸合成酶可将细胞感知干旱胁迫的信号传输至胁迫蛋白,调控与干旱防御相关的功能基因,从而加强对干旱胁迫的抵御;应激蛋白和DNA结合应激反应蛋白表达量的增加,可以帮助稳定蛋白质和多肽,当蛋白质发生错误后使之恢复正常,还能降解严重损伤的蛋白质,有效保护DNA免受各种损伤,以抵抗逆境胁迫,从而使B. japonicum 4792能够在干旱环境中生长和繁殖;ATP合成酶β亚基明显增加了表达量,可以提供更多的能量以确保根瘤菌株在适应胁迫冲击的过程中利用。因此,初步认为以上3种协助消除干旱胁迫途径可能是菌株B. japonicum 4792耐受干旱的重要机制。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章引言  9-19
  1.1 生物固氮的应用研究概况  9-12
    1.1.1 大豆根瘤菌优良菌株的选育  10-11
    1.1.2 提高生物固氮效率的技术研究  11-12
    1.1.3 根瘤菌新功能的拓展研究  12
  1.2 根瘤菌耐旱性研究  12-14
    1.2.1 根瘤菌对干旱的适应  12-13
    1.2.2 根瘤菌抗旱性分子机理研究  13-14
  1.3 根瘤菌蛋白质组研究进展  14-18
    1.3.1 蛋白质组学研究的背景及意义  14-15
    1.3.2 蛋白质组学研究技术  15-16
    1.3.3 蛋白质组学的鉴定技术  16-17
    1.3.4 根瘤菌的蛋白质组学研究进展  17-18
  1.4 研究的目的和意义  18-19
第二章耐旱大豆根瘤菌的筛选  19-26
  2.1 试验材料  19-21
    2.1.1 根瘤菌材料  19-20
    2.1.2 供试大豆品种  20
    2.1.3 供试土壤  20
    2.1.4 培养基和PEG6000 材料  20
    2.1.5 主要设备  20-21
  2.2 试验方法  21
    2.2.1 耐旱大豆根瘤菌的初筛试验  21
    2.2.2 耐旱大豆根瘤菌的复筛试验  21
  2.3 结果与分析  21-24
    2.3.1 耐旱大豆根瘤菌的初筛试验结果  21-23
    2.3.2 耐旱大豆根瘤菌的复筛试验结果  23-24
  2.4 讨论  24-26
第三章干旱条件下接种根瘤菌对大豆生理生化指标的影响  26-32
  3.1 材料  26-27
    3.1.1 菌株  26
    3.1.2 供试大豆品种  26
    3.1.3 供试土壤  26
    3.1.4 仪器  26-27
  3.2 试验方法  27-28
  3.3 结果与分析  28-30
    3.3.1 干旱胁迫下接种根瘤菌B. japonicum 4792 对大豆叶片甜菜碱含量的影响.  28
    3.3.2 干旱胁迫下接种根瘤菌B. japonicum 4792 对大豆叶片中叶SOD 活性的影响  28-29
    3.3.3 干旱胁迫下接种根瘤菌B. japonicum 4792 对大豆叶片中叶绿素含量(%)的影响.  29
    3.3.4 干旱胁下迫接种根瘤菌B .japonicum 4792 对大豆叶片中丙二醛含量的影响  29-30
  3.4 讨论  30-32
第四章大豆根瘤菌干旱胁迫时的蛋白质组学分析  32-45
  4.1 试验材料  32
  4.2 主要仪器设备  32
  4.3 主要试剂及配制  32-36
    4.3.1 试剂  32
    4.3.2 HB 缓冲液配制  32-34
    4.3.3 根瘤菌的培养  34
    4.3.4 蛋白质提取  34
    4.3.5 蛋白的溶解与定量  34
    4.3.6 双向电泳及凝胶染色  34-35
    4.3.7 蛋白质凝胶扫描及图像分析  35-36
    4.3.8 差异蛋白点的质谱分析  36
  4.4 结果与分析  36-43
    4.4.1 PEG6000 处理后菌株B. japonicum 4792 蛋白双向电泳及分析结果  36-38
    4.4.2 PEG6000 处理后引起的差异蛋白点的MALDI-TOF 质谱鉴定  38-39
    4.4.3 PEG6000 处理后菌株B. japonicum 4792 差异表达蛋白  39-43
  4.5 讨论  43-45
第五章结论与创新性  45-46
  5.1 本论文的主要结论  45
  5.2 创新点  45-46
参考文献  46-53
在读期间已发表论文  53-54
作者简历  54-55
致谢  55-56

大豆根瘤菌耐旱菌株的筛选及其蛋白组学研究

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