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海岛棉和陆地棉纤维发育的遗传基因组学研究

作　者: 陈向东
导　师: 张天真
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传育种学
关键词: 棉花微阵列纤维发育基因表达表达QTL
分类号: S562
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

棉花是我国最重要的经济作物之一,也是主要的自然纤维作物。中国是世界上最大的纺织品生产国和消费国,常年种植面积在8,000万亩左右,棉花种植业与纺织业在我国国民经济中起着重要的作用。但是,目前国产原棉在质量上已经不能满足市场需要,适纺高档棉纱的优质原棉,主要依赖进口。长期以来,我国棉花纤维品质偏差,平均跨长和比强度均较低,成为制约棉花产业可持续发展的主要障碍。纤维品质包括纤维长度、强度、细度等性状的综合指标受纤维的伸长和次生壁合成过程影响。因此,研究棉花纤维发育转录组以阐明纤维细胞基因表达模式,整合遗传和遗传基因组学以发掘影响纤维品质基因及了解棉纤维品质调控的分子机制,对改善纤维品质具有极为显著的意义。本研究开发了海陆群体的AFLP, SAMPL, SABPL和EST等分子标记,为本实验室构建的海陆遗传图谱增加了244个非SSR类型的多态位点,尤其是EST相关的功能标记。这些标记增加了遗传标记的类型,填充了染色体上某些空白区域。结合本实验加密的比较饱和海陆回交遗传图谱,我们整合四年纤检的纤维品质数据,利用多QTL联合分析方法检测了纤维长度、强度、细度、伸长率及整齐度等纤维品质性状基因型及环境互作效应,得到22个纤维品质QTL(LOD≥3),包括6个主效QTL,16个与环境互作的QTL；纤维长度和强度QTL主要定位在A亚组(A1、A3、A5和A11),而纤维整齐度和马克隆值QTL主要定位在D亚组(D1、D4、D7和D12)。一致或稳定的QTL将为研究影响纤维品质的候选基因提供基础。本研究利用高通量的微阵列平台,筛选了涉及陆地棉标准系TM-1纤维起始、伸长及次生壁加厚时期的差异表达基因。我们利用SAM (Significant Analysis of Microarray)软件的multiclass方法对28k棉花芯片上10,902个基因不同时期的信号强度分析,得到了6,186个时期差异表达基因(q-value≤5%)。 KEGG分析发现细胞骨架蛋白、类黄酮合成、氧化磷酸化和糖酵解代谢途径处于显著差异水平。我们对6,186个时期差异表达基因的11个时期平均最高信号强度值和次之信号值利用t-test方法(P<0.05)和1.5倍差异标准筛选,最终得到了192个时期特异表达的基因。这些时期特异表达基因决定了纤维细胞在特异时期的独特的分子事件。另外纤维的发育阶段也能够利用差异表达基因的聚类清晰的分开,在分子水平上分开了3个重要的纤维发育阶段。这项研究为四倍体栽培棉种的纤维发育机制提供了新的视点,也为纤维发育的研究提供了大量的特异表达基因资源,更为进一步通过遗传改良方法提高棉纤维的品质提供了一定基础。利用高通量的微阵列技术对陆地棉和海岛棉纤维基因表达进行了比较研究。我们测量了海岛棉Hai7124和陆地棉TM-1纤维整个伸长发育期不同时间点的长度(5-38days post anthesis, DPA),发现陆地棉和海岛棉纤维长度分别在15-20和23-28DPA之前线性增长,最终达到一个相对平稳的时期,较大的差异发生在20-33DPA。我们利用12k棉花纤维cDNA芯片与在5个时间点(5、10、15、20和25DPA)的Hai7124和TM-1纤维发育细胞的RNA杂交,利用R语言LIMMA软件包的经验贝叶斯(eBayes)方法在错误发现率FDR<0.05及2倍差异的标准下比较了发育纤维细胞在种内相邻时间点和种间差异表达基因的数目,在Hai7124相邻时期比较分别有276(5vs.10DPA),2402(10vs.15DPA),94(15vs.20DPA)和44(20vs.25DPA)个差异基因,而在TM-1分别得到473、2224、148和396个差异基因,在Hai7124和TM-1纤维细胞间5个时间点分别发现151、233、195、100和232个差异基因。10和25DPA有更多的差异表达基因,是两个非常关键的时期,对这两个时期的深入研究有利于弄清控制纤维快速伸长基因及决定海岛棉持续伸长或陆地棉停止伸长的基因。为了深入解析海陆棉花差异原因,发掘与纤维品质相关的基因,我们选择了10和25DPA的纤维进行了遗传基因组学研究。我们利用28k棉花cDNA芯片从10和25DPA的纤维细胞中分别检测到13,760和13,411个有效基因,利用R语言LIMMA软件包的经验贝叶斯(eBayes)方法,错误发现率控制在5%的水平上,发现在亲本TM-1和Hai7124间分别有142和302个差异表达基因。在这两个时期的66个棉花BC1S1株系分别用相同的芯片平台检测了表达谱,进一步用于连锁分析。在P<0.05水平上总共定位了916个表达QTL(eQTL),包括纤维伸长时期的293个和次生壁合成时期的623个；通过比较转录本的表达连锁位置和遗传标记定位预测了一些潜在的顺式或反式eQTL。另外,我们得到了46个eQTL热点,其中A亚组30个,D亚组16个,同时筛选了这些热点内包含的转录因子。比较eQTL与纤维QTL的位置,我们得到了一批纤维QTL在eQTL共定位的基因,尤其是在25DPA发现大量与纤维长度、强度和细度相关的基因,纤维品质可能由纤维品质QTL区域的基因表达调控因子影响,研究这些基因能够帮助我们进一步揭示海岛棉和陆地棉纤维长度差异的分子机制。结合这些研究结果,我们推测在纤维发育过渡阶段,ABA和乙烯信号途径基因的下调,生长素调控因子和细胞壁疏松酶等纤维伸长正向调控基因的长时间及高水平表达是海岛棉保持持续伸长的主要分子基础,这可能也是海岛棉具有优异的纤维品质的一个原因。棉花遗传和表达QTL的整合为纤维品质功能基因的发掘提供了新视点,有助于进一步通过分子手段改良棉花的纤维品质。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
本文所用主要缩略词  13-15
第一部分文献综述  15-65
  第一章棉花分子标记定位研究进展  15-29
    1 棉花的种类和基因型  15-16
    2 遗传图谱的DNA分子标记技术  16-21
    3 遗传连锁图谱的作图群体  21
    4 棉花分子遗传图谱研究进展  21-23
    5 植物QTL定位的方法  23-24
    6 棉花QTL作图研究进展  24-29
  第二章棉花纤维发育转录组研究进展  29-51
    1 棉花纤维细胞发育概述  29-30
    2 EST数据库  30-31
    3 转录组学的主要分析方法  31-34
      3.1 基于杂交的表达谱分析手段  32-33
      3.2 基于测序的表达谱分析手段  33-34
    4 棉花纤维发育转录组学研究进展  34-36
      4.1 微阵列技术在棉纤维上的应用  34-36
      4.2 第二代测序技术在棉纤维上的应用  36
    5 棉花纤维发育相关基因  36-48
      5.1 棉花纤维起始发育相关基因  38-40
      5.2 棉花纤维伸长发育相关基因  40-47
      5.3 棉花纤维次生壁加厚相关基因  47-48
    6 棉花转录组学未来的研究方向  48-51
  第三章植物遗传基因组学研究进展  51-63
    1 遗传基因组学概述  51
    2 eQTL研究方法  51-52
    3 植物eQTL研究进展  52-60
      3.1 基因表达的调控热点/主调控子  54-55
      3.2 顺式作用eQTL和反式作用eQTL  55-56
      3.3 筛选候选基因  56-59
      3.4 筛选基因调控网络  59-60
    4 eQTL研究的展望  60-63
  本研究目的与意义  63-65
第二部分研究报告  65-135
  第四章海岛棉和陆地棉分子标记的开发及纤维品质性状QTL定位  65-93
    1 材料与方法  65-75
      1.1 供试材料  65
      1.2 棉花DNA的提取  65-67
      1.3 AFLP方法  67-70
      1.4 SAMPL和SABPL方法  70-71
      1.5 REMAP标记的方法  71-73
      1.6 发掘EST标记的方法  73-74
      1.7 PCR产物检测  74
        1.7.1 琼脂糖电泳检测  74
        1.7.2 PAGE/银染检测  74
      1.8 遗传连锁分析  74
      1.9 表型性状调查纤维品质性状测定  74-75
      1.10 数量性状位点作图  75
    2 结果与分析  75-89
      2.1 海岛棉Hai7124和陆地棉TM-1的表型  75-76
      2.2 多态引物分析结果  76-81
      2.3 遗传连锁图的加密  81-83
      2.4 海岛棉和陆地棉回交群体纤维品质QTL的定位  83-89
        2.4.1 亲本和分离群体的数量性状表现  83-84
        2.4.2 纤维品质QTL的定位与分析  84-89
    3 讨论  89-93
      3.1 遗传图谱的加密  89-90
      3.2 纤维品质QTL定位分析  90-93
  第五章陆地棉纤维发育不同时期特异基因表达谱分析  93-107
    1 材料与方法  93-96
      1.1 植物材料  93
      1.2 RNA提取和纯化  93
      1.3 RNA样品标记探针  93-94
      1.4 cDNA芯片杂交  94
      1.5 芯片扫描  94
      1.6 统计分析  94-95
      1.7 聚类分析和功能注释  95
      1.8 定量PCR分析  95-96
    2 结果与分析  96-103
      2.1 陆地棉纤维发育不同时期转录组分析  96-97
      2.2 陆地棉纤维发育不同时期特异表达基因  97-102
      2.3 陆地棉纤维发育不同时期特异表达基因定量验证  102-103
    3 讨论  103-107
  第六章海岛棉和陆地棉纤维分化的遗传基因组学研究  107-135
    1 材料与方法  107-110
      1.1 试验材料  107
      1.2 纤维长度测量  107
      1.3 RNA提取和纯化  107-108
      1.4 RNA样品标记探针  108
      1.5 cDNA芯片杂交  108
      1.6 芯片扫描  108
      1.7 统计分析  108
      1.8 连锁分析  108-109
      1.9 定量分析  109-110
      1.10 分子定位  110
    2 结果与分析  110-128
      2.1 海岛棉Hai7124和陆地棉TM-1的纤维发育  110-111
      2.2 海岛棉和陆地棉种间和时期表达分析  111-116
      2.3 表达谱全基因组连锁分析  116-117
      2.4 eQTL热点  117-120
      2.5 整合纤维品质QTL和基因表达QTL  120-124
      2.6 主要差异基因的时期表达谱  124-126
      2.7 主要候选差异基因的定量验证  126-128
    3 讨论  128-135
      3.1 棉花微阵列芯片在差异基因表达方面的应用  128-129
      3.2 海岛棉纤维品质优异的分子机制  129-135
        3.2.1 海岛棉持续伸长的分子基础  129-131
        3.2.2 陆地棉过早停止伸长的分子基础  131-135
全文结论  135-137
参考文献  137-163
发表论文  163-165
致谢  165

海岛棉和陆地棉纤维发育的遗传基因组学研究

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