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小麦SA/JA信号路径中白粉病抗性相关基因筛选及功能研究

作　者: 汤丽川
导　师: 赵永亮
学　校: 河南工业大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: SA JA 抗白粉病 FAD
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

小麦是世界范围内最广泛种植的粮食作物，是世界三分之一人口的主粮。中国是世界上最大的小麦生产国和消费国。小麦白粉病是小麦最严重的病害之一，它是由专性寄生真菌—白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici，Bgt)引起的病害，在各主要产麦国均有分布。据报道，小麦白粉病可造成小麦13%～34%的产量损失。而过多依赖于农药，不仅增加了生产成本，而且还造成了大面积环境污染，严重威胁农业生态安全。因此，采用生物技术手段，克隆高抗小麦白粉病基因并将其应用于小麦抗病遗传育种是控制小麦白粉病流行最经济、安全、有效的方法。水杨酸（salicylicacid，SA）途径和茉莉酸（Jasmonicacidpathway，JA）途径是植物基因对基因介导抗性和诱导抗性中两条重要的信号途径。SA信号路径和JA信号路径在抗病反应中协调作用，互相制约，共同调控植物对病原菌的抵抗。本研究主要从外施SA/JA，观察其对白粉病的影响；白粉菌接种抗病材料和感病材料后，分析SA/JA路径基因表达变化情况；采用病毒诱导的基因沉默(virusinducedgenesilencing，VIGS)方法筛选抗病相关基因及对抗病相关基因的进一步研究等几个方面着手实验，获得的实验结果如下：1、对一叶一心的小麦外源喷施SA/JA，可以诱导北京837（感病材料）对白粉病的抗性增强，其中JA作用更加明显。2、从20个SA和JA信号路径的基因中筛选得到两个抗白粉病基因FAD（Ta-0109540）和HYP（Ta-1646165446）。3、获得TaFAD全长cDNA序列，经序列比对发现它与OsFAD2的相似性为88%，和AtFAD2的相似性为67%，确定其为TaFAD2；并发现在SA和JA处理下的小麦中，TaFAD2的表达水平基本不变。4、由VIGS实验发现：TaFAD2的沉默会使原来抗白粉病的小麦（PmA）局部感染白粉病；显微观察结果统计，TaFAD2的沉默增强了白粉菌孢子的侵染率，表型及显微观察结果都显示出小麦TaFAD2基因参与白粉病抗性反应。5、TaFAD2的VIGS植株中，JA路径基因表达水平明显降低，而SA路径基因的表达量则刚好相反，略微的上调。证明小麦TaFAD2基因是通过正向调控JA路径，负向调节SA路径来参与调控对白粉病的抗性。总之，对SA和JA/ET信号路径中小麦白粉病抗性基因的筛选和分子机制研究有利于开拓小麦的抗病改良新途径，提高作物抗病性，控制病害流行并为植株抗病遗传育种提供新的帮助。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章前言  12-25
  1.1 植物激素SA/JA参与植物抗病过程的研究进展  12-14
    1.1.1 植物防御信号转导  12-13
    1.1.2 SA/JA在植物抗病过程中的作用  13-14
  1.2 脂肪酸去饱和酶及其衍生物研究进展  14-22
    1.2.1 脂肪酸种类及其生物合成  14-16
    1.2.2 脂肪酸参与植物对细菌和真菌病害的基础防御  16-17
    1.2.3 脂肪酸参与R基因介导的植物抗性  17-19
    1.2.4 脂肪酸及其衍生物参与植物系统免疫  19-20
    1.2.5 植物防御反应中的重要氧化脂质  20-22
  1.3 病毒诱导的基因沉默研究进展  22-23
    1.3.1 VIGS研究进展  22
    1.3.2 VIGS实验的优点  22-23
    1.3.3 VIGS在单子叶植物中的应用  23
  1.4 本研究意义和技术路线  23-25
第二章实验材料与方法  25-36
  2.1 实验材料  25-26
    2.1.1 植物材料  25
    2.1.2 主要仪器  25
    2.1.3 主要试剂  25-26
  2.2 试验方法  26-36
    2.2.1 材料培养与处理  26-27
    2.2.2 离体培养  27
    2.2.3 小麦叶片总RNA的提取与检测  27-28
    2.2.4 cDNA第一链的合成与检测  28-29
    2.2.5 RealtimePCR  29-30
    2.2.6 VIGS载体的构建  30-33
      2.2.6.1 引物设计  30
      2.2.6.2 PCR反应  30
      2.2.6.3 目标片段的回收与纯化  30-31
      2.2.6.4 pEASY-T1Simple载体连接转化  31
      2.2.6.5 菌液PCR检测  31
      2.2.6.6 酶切检测  31-32
      2.2.6.7 BSMV-γ载体连接转化  32-33
    2.2.7 体外转录  33-34
    2.2.8 病毒接种及离体鉴定  34
    2.2.9 显微观察及次生菌丝的统计  34-35
      2.2.9.1 显微观察  34-35
      2.2.9.2 次生菌丝的统计  35
    2.2.10 TaFAD基因cDNA全长的分离与分析  35-36
第三章结果与分析  36-53
  3.1 外源SA/JA对小麦白粉病抗性的诱导作用  36-37
  3.2 SA/JA路径基因在接菌条件下的表达检测  37-44
    3.2.1 20个基因的信息及其RealtimePCR引物序列  37-40
    3.2.2 RealtimePCR结果  40-44
  3.3 抗病基因的筛选  44-46
    3.3.1 设计的10对VIGS引物  44-45
    3.3.2 VIGS实验筛选结果  45-46
  3.4 小麦TaFAD2基因的克隆与SA/JA处理下的表达检测  46-49
    3.4.1 TaFAD基因cDNA全长的分离与分析  46-48
    3.4.2 SA/JA处理下TaFAD2基因的表达检测  48-49
  3.5 TaFAD2抗病性鉴定  49-53
    3.5.1 TaFAD2的VIGS植株中TaFAD2的表达检测  49
    3.5.2 BSMV:TaFAD2的表型观察  49-50
    3.5.3 BSMV:TaFAD2的显微观察  50-51
    3.5.4 TaFAD2的VIGS植株中基因表达检测  51-53
第四章讨论  53-55
  4.1 TaFAD2参与抗白粉病或许是通过降低小麦内源18:1脂肪酸水平来实现的  53
  4.2 TaFAD2位于SA和JA路径的上游  53
  4.3 TaFAD2参与小麦抗病可能的工作机制  53-55
第五章结论  55-56
参考文献  56-62
致谢  62-63
个人简历、在学习期间的研究成果及发表的学术论文  63

小麦SA/JA信号路径中白粉病抗性相关基因筛选及功能研究

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