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诱导型水稻启动子OsBTF3调控元件的鉴定和功能分析

作　者: 马睿
导　师: 吴祖建; 何晨阳
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物病理学
关键词: OsBTF3 调控元件 LUC基因病原菌诱导ABA
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

植物启动子是控制植物基因转录的重要DNA序列，实现目的基因的调控表达，启动子的研究已成为基因工程热点。转基因工程中大多利用组成型启动子，持续驱动靶基因表达，但会对植株本身带来负效应。鉴定和利用诱导型启动子，无论对于基因表达调控机理的研究，还是应用于转基因研究都具有十分重要的科学意义。近年来，通过计算机预测和实验测定方法的有效结合，发掘和鉴定出了一些诱导型启动子，并进行了调控功能的解析，但有关水稻基因诱导型启动子的研究鲜有报道。本实验室前期通过对水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv. Nipponbare)悬浮细胞与水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)亲和互作后的表达进行cDNA-AFLP分析，发现水稻OsBTF3基因受Xoo诱导上调表达，推测OsBTF3可能是水稻与Xoo侵染相互作用中重要的调控因子之一。此外，利用RT-Q-PCR方法对OsBTF3基因表达进行测定，发现OsBTF3具有病原菌和信号分子应答特性。不同病原菌和信号分子对OsBTF3基因诱导活性不同，其中病原菌Xoo和脱落酸(ABA)诱导活性最强。为了从水稻基因中发掘新型的诱导型启动子，利用生物信息学分析预测OsBTF3基因编码区上游2065bp的启动子序列，发现该区域中除包含大量基本的启动元件外，还含有W-box、G box和MYB等与病原菌诱导和ABA诱导相关的调控元件。为进一步了解启动子的功能，以水稻基因组DNA为模板，PCR扩增启动子OsBTF3全长基因及一系列不同长度5’端缺失片段，分别连入瞬时表达载体LUC-PUC19，通过PEG介导转化拟南芥原生质体，然后分别用浓度为OD600=1.2病原菌Xoo和0.6mmol/L ABA诱导8h进行瞬时表达，测定LUC荧光活性的表达。发现在-1584bp/-1180bp含有在病原菌Xoo诱导中起主要作用的调控元件。在-1219bp/-1037bp含有ABA诱导中起主要作用的调控元件。通过生物信息学分析，发现在-1584bp/-1180bp含有3个调控元件，WBOXATNPR1，WRKY710S和SEBFWNSSTPR10A。区域-1219bp/-1037bp含有1个调控元件DPBFCOREDCDC3。为进一步确定起作用的元件，再分别克隆4个调控元件序列连入瞬时表达载体LUC-PUC19，原生质体瞬时表达测定LUC荧光活性的表达。发现LUC荧光活性表达强烈，说明-1584bp/-1180bp区域内的调控元件SEBFCONSSTPR10A在病原菌Xoo诱导过程中起重要作用。-1219bp/-1037bp区域内的调控元件DPBFCOREDCDC3在ABA诱导过程中起重要作用。此外，根据相关文献报道的调控元件的保守位点进行点突变，同样进行瞬时表达，发现LUC荧光活性完全丧失。前期试验发现多种病原菌对OsBTF3基因均有诱导活性，为进一步了解-1584bp/-1180bp发现的调控元件SEBFCONSSTPR10A对病原菌Xoo诱导是否具有特异性。利用不同病原菌Xoc，DC3000和燕麦嗜酸菌分别诱导进行瞬时表达，测定LUC荧光活性的表达。发现启动子OsBTF3全长基因受丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato,简称DC3000）诱导时，荧光活性达到最大，说明在病原菌DC3000诱导时，除调控元件SEBFCONSSTPR10A起作用外，可能还有其他的调控元件起作用。启动子受水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola,简称Xoc)诱导时荧光活性与Xoo诱导时基本一致，说明调控元件SEBFCONSSTPR10A在病原菌Xoc诱导过程中也起到重要作用。而燕麦嗜酸菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli,简称Aac）诱导后，荧光活性与未诱导时活性相当，说明OsBTF3基因启动子基本不受燕麦嗜酸菌的诱导。本研究基本明确了水稻启动子OsBTF3基因序列上受病原菌和ABA诱导起重要作用的调控元件、调控元件位点及功能。因此，本研究通过对启动子OsBTF3调控元件的鉴定和功能分析，对基因表达调控机理的研究和转基因水稻研究中加以利用都具有十分重要的科学意义。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
第一章前言  11-23
  1 水稻白叶枯病研究进展  11-12
    1.1 水稻白叶枯病  11
    1.2 水稻白叶枯病抗性基因的鉴定  11
    1.3 水稻—白叶枯病菌互作基因研究  11-12
  2 OsBTF3 基因研究进展  12-14
  3 植物启动子概述  14-21
    3.1 启动子结构特征  14-15
    3.2 启动子分类  15-16
    3.3 启动子序列克隆方法  16-17
    3.4 启动子功能分析方法  17-21
    3.5 植物启动子的应用  21
  4 本研究的目的及意义  21-23
第二章实验材料与方法  23-40
  1 供试材料  23-25
    1.1 菌株和质粒  23
    1.2 供试植株  23
    1.3 主要仪器与试剂  23
    1.4 引物设计  23-25
    1.5 常用缓冲液的配制  25
  2. 实验方法  25-40
    2.1 植物启动子顺式作用元件在线分析网站  25
    2.2 原生质体转化 W5 溶液对水稻白叶枯病菌生长及致病性的影响  25-27
    2.3 水稻幼叶总 DNA 提取  27-28
    2.4 PCR 扩增启动子 OsBTF3 全长及 5’端缺失基因片段  28-29
    2.5 PCR 产物的纯化回收  29
    2.6 pMD18-T 载体与目的片段的连接  29
    2.7 连接产物转化大肠杆菌 DH5α  29-30
    2.8 重组质粒的提取与验证  30-31
    2.9 瞬时表达载体的构建与鉴定  31-32
    2.10 瞬时表达载体的大量提取  32-33
    2.11 拟南芥原生质体的分离与转化  33-34
    2.12 病原菌 Xoo 诱导拟南芥原生质体  34-37
    2.13 ABA 诱导拟南芥原生质体  37-40
第三章结果与分析  40-62
  1 植物启动子顺式作用元件分析  40
  2 原生质体转化系统 W5 溶液对水稻白叶枯病菌生长及致病性的影响  40-42
    2.1 W5 溶液对病原菌 Xoo 生长活性的影响  41
    2.2 W5 溶液对病原菌致病性的影响  41-42
  3 启动子 OsBTF3 全长及 5’端缺失基因片段的 PCR 扩增  42-46
    3.1 启动子全长基因的 PCR 扩增  42-43
    3.2 病原菌 Xoo 诱导的启动子 5’端缺失片段的 PCR 扩增  43-45
    3.3 ABA 诱导的启动子 5’端缺失片段的 PCR 扩增  45-46
  4 启动子 OsBTF3 全长及 5’端缺失片段的克隆  46-49
    4.1 启动子全长的克隆  46-47
    4.2 病原菌 Xoo 诱导的启动子 5’端缺失片段的克隆  47-49
    4.3 ABA 诱导的启动子 5’端缺失片段的克隆  49
  5 瞬时表达载体的构建  49-52
    5.1 启动子 OsBTF3 全长基因瞬时表达载体的构建  49-50
    5.2 病原菌 Xoo 诱导的启动子 5’端缺失片段瞬时表达载体的构建  50-51
    5.3 ABA 诱导的启动子 5’端缺失片段瞬时表达载体的构建  51-52
  6 拟南芥原生质体的分离与转化  52
  7 病原菌 Xoo 诱导拟南芥原生质体  52-57
    7.1 病原菌 Xoo 诱导拟南芥原生质体的最适浓度及时间  52-53
    7.2 启动子 OsBTF3 基因中受病原菌 Xoo 诱导的调控元件  53-54
    7.3 调控元件保守位点的点突变  54-55
    7.4 CCD 成像验证调控元件功能  55-56
    7.5 其他病原菌对启动子 OsBTF3 的诱导  56-57
  8 ABA 诱导拟南芥原生质体  57-62
    8.1 ABA 诱导拟南芥原生质体的最适浓度及时间  57-58
    8.2 启动子 OsBTF3 基因中受病原菌 Xoo 诱导的调控元件  58-59
    8.3 调控元件保守位点的点突变  59-60
    8.4 CCD 成像验证调控元件功能  60-62
第四章问题与讨论  62-66
  1 启动子 OsBTF3 调控元件的功能分析  62-63
  2 原生质体瞬时表达体系的选择  63-66
参考文献  66-70
附录 1 缩写词与中英文对照  70-72
附录 2 所用主要试剂及缓冲液的配制方法  72-74
附录 3 载体图谱  74-76
致谢  76

诱导型水稻启动子OsBTF3调控元件的鉴定和功能分析

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