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蓟柄锈菌的离体保存、遗传多态性分析与生物安全性评价

作　者: 张峻铨
导　师: 时焦
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: 蓟柄锈菌离体保存遗传多态性生物安全评价
分类号: S451
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

农田杂草防除是农业生产过程的重要环节，人工除草是农田杂草防治的传统方法。化学除草剂的问世与应用为农田杂草防除提供了便捷的途径。随着化学除草剂的大量使用，杂草抗药性不断加重，并相继带来环境污染问题和对人类健康的威胁。因此，安全而有效的杂草防除方法探索已引起人们的广泛关注。通常植物病原物引发植物病害，属于有害生物类群，但用其防治杂草的思路，为杂草防治提供了新的途径。我们在杂草病菌调查中发现了未见前人详细记载与报道的蓟柄锈菌（Puccinia obtegens），对其跟踪研究发现，该菌能使染病小蓟死亡，具有生物除草制剂的潜在开发价值。本研究论文对侵染杂草小蓟的蓟柄锈菌（P. obtegens）进行了系统的研究，研究内容主要包括以下几个方面：第一，蓟柄锈菌（P. obtegens）的离体保存技术研究；第二，蓟柄锈菌（P. obtegens）的遗传多态性分析；第三，蓟柄锈菌（P. obtegens）的生物安全性评价。蓟柄锈菌（P. obtegens）作为一种专性寄生菌，人们通常认为其夏孢子只能在活体植株上繁殖与保存，故存在纯化、培养和保存困难等问题，这给蓟柄锈菌（P. obtegens）的生物学、遗传学研究和应用造成了很大的阻力。为了改善这一现状，克服现有技术中存在的缺点，本研究发现了一种保存简单、操作方便、并能够达到研制生防制剂目的的新型离体保存方法。该方法借鉴了植物种子包衣技术，将蓟柄锈菌（P. obtegens）夏孢子粘附于烟草种子表面，再使用多种包衣粉剂包衣成颗粒，分别于4℃和-20℃条件下保存，定期进行萌发试验，记录夏孢子萌发率。结果表明，夏孢子的活性随着保存时间的延长而逐渐降低，但70%的夏孢子保存120天以上仍具有萌发活力。为了深入探索蓟柄锈菌（P. obtegens）的应用潜力，对蓟柄锈菌（P. obtegens）的遗传多态性进行了研究，从50条RAPD（RandomAmplified Polymorphic DNAs）随机引物中选取多态扩增性强的15条引物，对蓟柄锈菌（P. obtegens）的22个样品和3个大蓟上采集的锈病菌样品基因组DNA进行扩增，并构建指纹图谱。25个样品包括来自不同地区的9个夏孢子样品，不同孢子类型的6个样品，同一地点不同采集时间的7个夏孢子样品和3个大蓟上采集的样品。结果显示，扩增共产生DNA标记谱带204条，多态性谱带数为160条，多态检测率为78.4%。利用SAS（StatisticalAnalysis System）统计分析软件对样品的PCR结果进行了UPGMA（非加权类平均法）聚类分析。结果显示，供试3组样品可分别划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个聚类组。研究结果证明，供试样品具有丰富的遗传多态性，且样品间的亲缘关系与来源地、孢子类型和采集时间有一定的相关性。生物安全性评价是开发真菌除草剂的必要条件。为了评价蓟柄锈菌（P. obtegens）的生物安全性，用经过纯化的蓟柄锈菌（P. obtegens）对烟草、辣椒等茄科作物，小麦、玉米、大豆等主要农作物，大蓟、马齿苋、牛筋草、马塘等其他农田常见杂草进行了人工接种试验，同时接种小蓟作为对照。结果表明，除小蓟发病外，其它被接种植物均无发病症状。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章引言  12-19
  1.1 杂草生物防治的发展  12-15
    1.1.1 杂草生物防治的形成  12
    1.1.2 真菌在杂草生物防治中的作用  12-13
    1.1.3 真菌除草剂在国内外的发展现状  13-14
    1.1.4 锈菌防治农田杂草的研究现状  14-15
  1.2 烟田杂草小蓟锈病菌的发现  15
    1.2.1 小蓟锈病的发现  15
    1.2.2 锈病菌的主要症状  15
  1.3 分子标记技术在植物病原物研究中的应用  15-16
    1.3.1 DNA 分子标记技术研究概况  15-16
    1.3.2 RAPD 分子标记技术的应用  16
  1.4 杂草生物防治在烟田中的应用研究与展望  16-17
  1.5 本项目研究的目的与意义  17-19
第二章蓟柄锈菌的离体保存研究  19-25
  2.1 材料与方法  19-22
    2.1.1 供试样品  19
    2.1.2 试验试剂与主要仪器  19-20
    2.1.3 包衣方法  20-21
    2.1.4 包衣样品冷冻保存处理  21
    2.1.5 包衣样品的保湿萌发及观察  21-22
  2.2 结果与分析  22-24
    2.2.1 包衣样品的萌发观察  22
    2.2.2 包衣样品 B1 的观察结果  22-23
    2.2.3 包衣样品 B2 的观察结果  23-24
  2.3 小结与讨论  24-25
第三章蓟柄锈菌遗传多态性的 RAPD 分析  25-34
  3.1 材料与方法  25-29
    3.1.1 供试样品  25-27
    3.1.2 试验试剂与主要仪器  27
    3.1.3 缓冲液 TBE 的配制  27
    3.1.4 DNA 的提取  27-28
    3.1.5 RAPD—PCR 扩增与引物筛选  28-29
    3.1.6 扩增产物的分析方法  29
  3.2 结果与分析  29-33
    3.2.1 不同来源样品的随机扩增多态性分析结果  29-31
    3.2.2 通过聚类分析显示的遗传分化  31-33
  3.3 小结与讨论  33-34
第四章蓟柄锈菌的生物安全性评价  34-39
  4.1 材料与方法  34-35
    4.1.1 试验材料  34
    4.1.2 主要仪器  34
    4.1.3 小蓟的繁育  34
    4.1.4 蓟柄锈菌（P. obtegens）的接种方法  34-35
    4.1.5 生物安全试验  35
  4.2 结果与分析  35-38
    4.2.1 小蓟播种出苗  35-36
    4.2.2 蓟柄锈菌（P. obtegens）接种小蓟  36-37
    4.2.3 蓟柄锈菌（P. obtegens）接种其他作物和杂草  37-38
  4.3 小结与讨论  38-39
第五章全文结论  39-41
  5.1 蓟柄锈菌的保存技术研究  39
  5.2 蓟柄锈菌的遗传多态性研究  39
  5.3 蓟柄锈菌的生物安全性研究  39-41
附图  41-42
参考文献  42-47
致谢  47-48
在读期间申请专利与发表论文  48
作者简介  48

蓟柄锈菌的离体保存、遗传多态性分析与生物安全性评价

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