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柑橘衰退病毒S45分离物序列分析及蚜虫传播对其群体结构的影响

作　者: 金凤银
导　师: 洪霓
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 柑橘衰退病毒 序列比对 群体结构 褐色橘蚜 传毒
分类号: S436.661
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)引起的柑橘衰退病(Tristeza)是柑橘上发生最广泛、为害严重的病毒病,对柑橘产业存在严重的威胁。CTV属于长线形病毒科(Closteroviridae)长线形病毒属(Closterovirus)成员,基因组全长约为19.3kb,是已知基因组最大的植物病毒,目前已报道有27个CTV分离物的全基因组序列。由于该病毒的高度分子变异及重组现象的普遍存在,该群体结构也相对较复杂。在自然条件下,CTV主要通过蚜虫传播,其中褐色橘蚜是其最有效的传播媒介。本研究组前期研究发现CTV分离物S45(CTV-S45)内存在多个分子变种,并对其部分序列进行了分析。为进一步明确该CTV分离物的群体结构和分子特点,本研究进一步对CTV-S45进行了基因组序列研究,并分析了蚜虫传播后其分子变种组成的变化,结果如下：1.在前期初步测序的基础上,分6个片段设计8对引物,对CTV-S45基因组的5’端6-5340nt和近3’端9516-15965nt进行RT-PCR扩增,每扩增片段选取3-11个单克隆进行测序,序列比对的结果显示,各片段均存在一定分子变异,为2-6个分子变种组成的群体。其中U(6-725nt)、X(9516-11236nt)和Z(13426-15965nt)片段存在与弱毒株系T30及强毒株系NZRB-G90分别具有较高序列相似性的分子变种,相似性在97.8-99.0%。X片段的分子变种组成最为复杂,具6个分子变种。序列比对发现X和W片段存在重组现象。2.采用DNAMAN软件对本研究所测定序列和本实验室前期获得的序列进行比对和拼接,获得1个19256nt(命名为S45-R)的全长基因组序列和2个大小分别为9690nt (S45-R1,1-9690nt)和5120nt (S45-R2,10846-15965nt)的部分基因组序列。核苷酸序列比对结果表明,S45-R与GenBank上已登录的27个分离物的基因组序列相似性为80.0%-90.9%,与弱毒株系T30核苷酸序列相似性最高,为90.9%,但其CP基因与强毒株系NZRB-G90相似性最高,为97.5%,与T30为91.5%；测定P23蛋白的某个氨基酸来鉴定强弱毒株系显示为弱毒株系,该结果进一步表明CTV-S45基因组内存在重组现象。S45-R1与T30相应部分序列相似性最高,为98.2%。S45-R2与NZRB-G90相应序列相似性最高,为98.1%。3.以CTV-S45为毒源,采用褐色橘蚜对22株甜橙实生苗进行传毒,3个月后进行病毒检测的结果显示,3株甜橙实生苗(TV1、TV12、TV13)感染CTV-S45。采用RT-PCR技术分别对TV1、TV12和TV13植株中CTV的U、X、Z片段和CP进行进行扩增和测序,结果显示蚜传亚分离物内和亚分离物间的相似性均达99%以上,且各片段与S45-R相应序列相似性达98.5-99.8%。该结果表明褐色橘蚜对CTV分子变种传播具有选择性,本研究获全基因组序列S45-R来自该蚜传亚分离物。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略语表  10-11
1. CTV的生物学及分子生物学研究进展  11-20
  1.1 CTV的基因组特征  11-14
    1.1.1 CTV的基因组  11-13
    1.1.2 CTV的基因组结构及基因功能  13-14
  1.2 CTV的变异和重组现象  14-15
  1.3 CTV的检测  15-16
  1.4 CTV的传播与流行学  16-18
    1.4.1 CTV的寄主范围  16
    1.4.2 柑橘主要蚜虫种类及分布  16-17
    1.4.3 CTV的传播特点  17-18
  1.5 蚜虫传播CTV的机制  18-19
  1.6 CTV传播效率的影响因子  19-20
2 研究目的与意义  20-21
3 材料与方法  21-31
  3.1 研究材料  21-22
    3.1.1 毒源材料  21
    3.1.2 试剂  21
    3.1.3 引物设计  21-22
    3.1.4 介体蚜虫  22
    3.1.5 接毒植株  22
  3.2 研究方法  22-31
    3.2.1 RNA提取  22-24
    3.2.2 RT-PCR  24-25
    3.2.3 RT-PCR产物的克隆  25-27
    3.2.4 阳性克隆的SSCP分析  27
    3.2.5 测序及序列分析  27
    3.2.6 阳性克隆质粒的提取和保存  27-28
    3.2.7 蚜虫传毒  28-31
4 结果与分析  31-48
  4.1 CTV-S45基因组部分片段的扩增结果  31-32
  4.2 扩增片段的序列分析  32-38
    4.2.1 序列间相似性分析  32-36
    4.2.2 重组分析  36-38
  4.3 CTV-S45基因组序列分析  38-44
    4.3.1 CTV-S45基因组序列拼接  38
    4.3.2 S45-R序列分析  38-42
      4.3.2.1 S45-R系统进化树构建及分基因比对结果  38-40
      4.3.2.2 S45-R重组分析  40-42
    4.3.3 S45-R1和S45-R2序列分析  42-44
  4.4 CTV-S45分子变种组成  44-45
  4.5 蚜虫传播对CTV-S45分离物分子变种组成的影响  45-48
    4.5.1 蚜虫传播CTV-S45的效率  45
    4.5.2 蚜传CTV-S45亚分离物的分子鉴定  45-48
5 讨论  48-50
参考文献  50-61
附录1：主要试剂和溶液的配制  61-62
附录2：S45-R基因组序列  62-70
附录3：本实验室保存的序列  70-71
致谢  71

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 柑桔类病虫害 > 柑桔病虫害
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