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杧果炭疽病菌对咪鲜胺的室内抗药性研究

作　者: 王小琴
导　师: 许文耀
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物病理学
关键词: 杧果炭疽病 胶孢炭疽菌 咪鲜胺 抗药突变体 抗药机制
分类号: S436.67
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


杧果炭疽病是杧果生产和储运过程中的重要病害。咪鲜胺是当前杧果生产中用于防治炭疽病的主要药剂之一。但杧果炭疽菌【Colletotrichum glosoporioides （Penz.）Sacc.】对咪鲜胺的抗药性研究目前尚处于空白。本文在室内药剂驯化出一株杧果炭疽菌抗咪鲜胺突变体（MCGM）的基础上，比较了突变体和野生菌株（MCGW）的离体适合度，初步评估了咪鲜胺的抗性风险，探索了MCGM抗药的生理机制和分子机制。得出结果如下：从含咪鲜胺12g·mL-1的平板中获得了一株抗性突变体，连续无药培养9代后抗药性基本能保持稳定。MCGM菌丝粗壮，菌丝干重显著高于MCGW。部分分生孢子变异为圆形。相同条件下MCGM分生孢子的萌发率高于MCGW。但在菌丝生长速率、产孢量、附着胞形成率、分生孢子和附着胞的平均大小等方面，MCGM显著低于MCGW。致病力测定结果显示，MCGM对杧果花器的致病力高于MCGW，而MCGM对杧果幼果的致病力则明显低于MCGW。交互抗药性测定结果表明，咪鲜胺能与作用机制相同或相似的DMIs类杀菌剂之间产生正交互抗药性，与苯并咪唑类杀菌剂之间没有交互抗药性。抗性生理生化机制研究表明：在光学显微镜下，药剂处理后MCGM菌丝顶端生长受阻，膨大畸形，菌丝过度分支，菌丝比表面积增加，加大了与外界的物质交换；透射电镜结果显示，MCGM细胞内电子致密体颜色变浅，液泡、线粒体、脂滴等结构增加，而细胞壁加厚程度较MCGW小。MCGM通过增加细胞内膜系统以加强对杀菌剂的排泄作用。MCGM菌丝细胞膜透性显著高于MCGW菌丝，一定程度上增加了对杀菌剂的排泄作用。MCGM与MCGW对高糖和高盐渗透压均不敏感。咪鲜胺对MCGM菌丝的呼吸可产生双重影响，MCGM的呼吸作用强于MCGW，一定程度上增加了对咪鲜胺的代谢强度。抗性分子机制研究表明：CYP51基因的第114位和第1633位碱基由G突变为A，对应的氨基酸位点的第26位由Val（缬氨酸）突变为Ile（异亮氨酸），145位Asp（天冬氨酸）突变为Asn（天冬酰胺）。取代氨基酸结构相似，疏水性增加，与药剂的亲和性降低。而表现抗药性。MCGM CYP51基因的表达量比MCGW提高了13.045倍，编码的CYP51酶量增加，补偿了药剂对麦角甾醇生物合成的影响。认为，抗药性产生的原因是CYP51基因点突变和基因表达量上升的共同结果。

全文目录


目录  5-9
摘要  9-11
Abstract  11-13
第一章 前言  13-23
  1 杧果炭疽病的发生  13-15
    1.1 病原菌  13-14
    1.2 C. gloeosporioides 生物学特性  14
    1.3 寄主和危害症状  14
    1.4 侵染循环和侵染机制  14-15
  2 杧果炭疽菌的防治  15-17
    2.1 药剂防治  15-16
    2.2 生物防治  16
    2.3 农业防治  16
    2.4 采后防治  16-17
  3 植物病原菌的抗药性  17-22
    3.1 植物病原菌的抗药性成因与危害  17-18
    3.2 杧果炭疽病菌的抗药性现状  18
    3.3 麦角甾醇生物合成抑制剂  18-19
    3.4 咪鲜胺对病原真菌的作用机制  19-20
    3.5 真菌对咪鲜胺的抗药性机制  20-21
    3.6 DMIs 杀菌剂的抗性治理  21-22
  4 本研究的目的和意义  22-23
第二章 杧果炭疽病菌对咪鲜胺的室内抗药性诱导和离体适合度研究  23-46
  1 材料与方法  23-24
    1.1 供试菌种  23
    1.2 供试药剂  23
    1.3 供试培养基  23-24
  2 实验方法  24-30
    2.1 病原菌的分离和鉴定  24-25
      2.1.1 杧果炭疽病菌的分离和形态特征观察  24-25
    2.2 MCGW 对咪鲜胺的敏感性测定  25-26
      2.2.1 菌丝对咪鲜胺的敏感性测定  25
      2.2.2 分生孢子对咪鲜胺的敏感性测定  25-26
    2.3 突变体的诱导  26-27
      2.3.1 药剂驯化  26
      2.3.2 突变体的抗药水平测定  26
      2.3.3 MCGM 的抗药稳定性研究  26-27
    2.4 MCGM 生物学性状研究  27-29
      2.4.1 MCGM 的培养性状  27
      2.4.2 MCGM 生长速率测定  27
      2.4.3 MCGM 的产孢能力  27
      2.4.4 菌丝干重测定  27
      2.4.5 MCGM 形态学观察  27
      2.4.6 MCGM 分生孢子萌发率和附着胞形成率测定  27-28
      2.4.7 MCGM 的致病力测定  28-29
      2.4.8 交互抗药性测定  29
    2.5 MCGM 生物学特性测定  29-30
      2.5.1 温度对 MCGM 和 MCGW 菌丝生长、产孢量、孢子萌发和附着胞的影响  29
      2.5.2 不同培养时间对 MCGM 和 MCGW 产孢量的影响  29
      2.5.3 不同培养时间对 MCGM 和 MCGW 孢子萌发和附着胞形成的影响  29-30
      2.5.4 pH 对 MCGM 和 MCGW 菌丝生长、产孢量、孢子萌发和附着胞形成的影响  30
      2.5.5 光照对 MCGM 和 MCGW 菌丝生长、产孢量、孢子萌发和附着胞的影响  30
      2.5.6 不同培养基对 MCGM 和 MCGW 菌丝生长、产孢量的影响  30
      2.5.7 不同营养对 MCGM 和 MCGW 孢子萌发和附着胞形成的影响  30
  3 结果与分析  30-44
    3.1 杧果炭疽病菌形态特征  30-32
      3.1.1 病原菌培养性状  30-31
      3.1.2 分生孢子、芽管、附着胞、侵染钉的形态特征  31-32
    3.2 MCGW 对咪鲜胺的敏感性  32
    3.3 MCGM 的药剂诱导  32-33
    3.4 MCGM 的抗性水平  33
    3.5 MCGM 的遗传稳定性  33-34
    3.6 MCGM 的生物学性状  34-40
      3.6.1 MCGM 的培养性状  34-35
      3.6.2 MCGM 的生长速率  35
      3.6.3 MCGM 的产孢能力  35-36
      3.6.4 MCGM 的形态和菌丝干重  36-37
      3.6.5 MCGM 的形态特征  37
      3.6.6 MCGM 的致病力  37-39
      3.6.7 交互抗药性测定  39-40
    3.7 MCGM 生物学特性  40-44
      3.7.1 温度对 MCGM 和 MCGW 菌丝生长、产孢量、孢子萌发和附着胞的影响  40-41
      3.7.2 不同培养时间对 MCGM 和 MCGW 产孢量的影响  41
      3.7.3 不同培养时间对 MCGM 和 MCGW 孢子萌发和附着胞形成的影响  41-42
      3.7.4 不同 pH 对 MCGM 和 MCGW 菌丝生长、产孢量、孢子萌发和附着胞形成的影响  42
      3.7.5 光照对 MCGM 和 MCGW 菌丝生长、产孢量、孢子萌发和附着胞的影响  42-43
      3.7.6 不同培养基对 MCGM 和 MCGW 菌丝生长、产孢量的影响  43
      3.7.7 不同营养对 MCGM 和 MCGW 分生孢子萌发和附着胞形成的影响  43-44
  4 小结与讨论  44-46
第三章 杧果炭疽菌抗药性产生的生理生化机制研究  46-62
  1 供试材料  46-47
    1.1 供试菌株  46
    1.2 供试药剂  46
    1.3 主要仪器  46-47
    1.4 供试培养基  47
  2 实验方法  47-50
    2.1 咪鲜胺作用下 MCGM 和 MCGW 菌丝生长的显微观察  47
    2.2 咪鲜胺对 MCGM 和 MCGW 菌丝透射电镜观察  47-48
    2.3 咪鲜胺对 MCGM 和 MCGW 菌丝和分生孢子细胞膜通透性的影响  48
    2.4 MCGM 和 MCGW 菌丝和分生孢子渗透压测定  48-49
    2.5 咪鲜胺对 MCGM 和 MCGW 有氧呼吸的影响  49-50
  3 结果与分析  50-59
    3.1 咪鲜胺作用下 MCGM 和 MCGW 菌丝生长的显微观察  50-52
    3.2 咪鲜胺对 MCGM 和 MCGW 菌丝透射电镜观察  52-54
    3.3 咪鲜胺对 MCGM 和 MCGW 菌丝和分生孢子细胞膜通透性的影响  54-56
    3.4 MCGM 和 MCGW 菌丝和分生孢子渗透压测定  56-58
    3.5 咪鲜胺对 MCGM 和 MCGW 菌丝有氧呼吸的影响  58-59
  4 小结与讨论  59-62
第四章 杧果炭疽菌抗药性产生的分子机制研究  62-93
  1 实验材料  62-63
    1.1 供试真菌和细菌  62
    1.2 试剂和药品  62-63
    1.3 实验仪器  63
    1.4 PCR 引物  63
  2 实验方法  63-71
    2.1 CYP51 基因突变的研究  63-68
      2.1.1 MCGW 和 MCGM DNA 的提取  63-64
      2.1.2 CYP51 基因序列的保守区域引物的设计和合成  64
      2.1.3 CYP51 基因全长引物的设计和合成  64
      2.1.4 CYP51 保守区域的 PCR 扩增  64-65
        2.1.4.1 PCR 反应体系  65
        2.1.4.2 PCR 反应参数设置  65
      2.1.5 CYP51 基因全长的 PCR 扩增  65
        2.1.5.1 PCR 反应体系  65
        2.1.5.2 PCR 反应参数设置  65
      2.1.6 电泳检测  65-66
      2.1.7 PCR 产物的纯化回收  66
      2.1.8 PCR 回收产物的连接  66-67
        2.1.8.1 连接体系  66
        2.1.8.2 连接产物的转化  66-67
      2.1.9 重组克隆的鉴定  67-68
        2.1.9.1 菌落 PCR 鉴定  67
        2.1.9.2 质粒的提取  67-68
        2.1.9.3 质粒的酶切鉴定  68
      2.1.10 序列测定和分析  68
    2.2 CYP51 基因表达量的测定  68-71
      2.2.1 MCGW 和 MCGMRNA 的提取  68-69
      2.2.2 反转录  69-70
      2.2.3 CYP51 基因和内参基因荧光定量引物的设计  70
      2.2.4 荧光定量引物可靠性检测  70-71
        2.2.4.1 qPCR 反应  70-71
        2.2.4.2 引物 qPCR 的扩增效率  71
      2.2.5 CYP51 基因表达量检测及结果计算  71
  3 结果与分析  71-90
    3.1 CYP51 基因序列的保守区域的扩增  71-73
      3.1.1 菌落 PCR 鉴定  72
      3.1.2 质粒的酶切鉴定  72-73
      3.1.3 CYP51 基因序列保守区域测序结果  73
    3.2 CYP51 基因全长的 PCR 扩增  73-87
      3.2.1 菌落 PCR 鉴定  73
      3.2.2 质粒的酶切鉴定  73-75
      3.2.3 测序结果和分析  75-87
    3.3 CYP51 基因表达量的测定  87-90
      3.3.1 荧光定量引物可靠性检测  87-88
        3.3.1.1 溶解曲线  87-88
        3.3.1.2 电泳鉴定  88
      3.3.2 荧光定量引物扩增效率的检测  88-89
      3.3.3 CYP51 基因表达量  89-90
  4 小结与讨论  90-93
第五章 全文小结  93-97
  1 本文获得的主要实验结果  93-95
    1.1 抗性诱导  93
    1.2 抗性 MCGM 离体适合度  93-94
    1.3 抗药性产生的生理生化机制  94-95
    1.4 抗药性产生的分子机制  95
  2 问题和展望  95-97
附录  97-100
参考文献  100-107
致谢  107

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 热带及亚热带果类病虫害
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