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番茄上三种主要病原细菌的高通量检测

作　者: 王婷
导　师: 胡方平
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物病理学
关键词: 番茄病原细菌锁式探针滚环扩增反向斑点杂交高通量
分类号: S436.412
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 4次
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内容摘要

以番茄上危害较大的3种病原细菌:番茄细菌性溃疡病菌Clavibactermichiganense subsp. michiganse(CMM)、番茄细菌性斑点病菌Pseudomonas syringaepv. tomato(PST)和番茄青枯病菌Ralstonia solanacearum(RS)为研究对象，分别以这3种细菌的基因片段作为靶标序列，以小鼠xist基因中的两段序列作为连接序列，根据设计原则设计锁式探针以及通用引物,优化并建立滚环扩增检测体系，并与常规PCR进行对比，比较二者的灵敏度和特异性；之后针对这3种病原细菌，建立起基于锁式探针的反向斑点杂交技术体系，并测试其灵敏度和特异性。研究结果表明，根据番茄溃疡、番茄斑点、番茄青枯病原菌的特异序列和锁式探针的设计原则，设计出的3条锁式探针，通过对其特异性和灵敏度的检测，表明设计的这3条锁式探针特异性好，灵敏度高，可以实现对靶标序列的特异性检测；优化后的滚环扩增的体系，可以特异性地检测出这3种病原菌，而检测不出其他的病原菌，而且滚环扩增的灵敏度达到500fg/μL，比常规PCR高出1个数量级；结合地高辛标记的滚环扩增与反向斑点杂交技术，成功地检测出混合的3种番茄病原细菌，从而为这3种病原物的检测建立了新的方法，初步实现了对番茄细菌性病害的高通量检测。

全文目录

目录  5-7
摘要  7-8
Abstract  8-9
1 前言  9-18
  1.1 番茄细菌性病害  9
  1.2 植物病原细菌的检测方法  9-13
    1.2.1 常规检测方法  9-10
    1.2.2 血清学技术  10-11
    1.2.3 DNA 分子检测技术  11-13
  1.3 锁式探针的滚环 DNA 扩增技术  13-17
    1.3.1 滚环扩增的原理  13-14
    1.3.2 滚环扩增的分类  14
    1.3.3 滚环扩增的优势  14-15
    1.3.4 滚环扩增存在的问题和解决方法  15-16
    1.3.5 滚环扩增的应用  16-17
    1.3.6 滚环扩增的展望  17
  1.5 研究目的与意义  17-18
  1.6 技术路线  18
2 材料与方法  18-26
  2.1 材料  18-19
    2.1.1 供试菌株  18-19
    2.1.2 主要试剂和仪器  19
  2.2 锁式探针的设计  19-20
  2.3 反向斑点杂交法检测环化锁式探针的原理  20-21
  2.4 滚环扩增体系优化  21-24
    2.4.1 提取 DNA  21
    2.4.2 连接反应  21-22
    2.4.3 消化反应  22
    2.4.4 滚环扩增  22-23
    2.4.5 连接酶依赖性 PCR 检测  23
    2.4.6 滚环扩增的特异性检测  23
    2.4.7 滚环扩增的灵敏度检测  23
    2.4.8 CMM、PST 和 RS 的混合检测  23-24
  2.5 反向斑点杂交  24-26
    2.5.1 地高辛标记  24
    2.5.2 反向斑点杂交  24-25
    2.5.3 反向斑点杂交检测的特异性  25
    2.5.4 反向斑点杂交检测的灵敏度  25-26
3 结果与分析  26-36
  3.1 滚环扩增体系的建立  26-34
    3.1.1 番茄 3 种细菌性病原菌 DNA 的提取  26
    3.1.2 滚环扩增体系的优化  26-30
    3.1.3 滚环扩增体系的特异性测定  30-32
    3.1.4 滚环扩增体系的灵敏度测定  32-33
    3.1.5 CMM、PST 和 RS 的混合检测  33-34
  3.2 反向斑点杂交  34-36
    3.2.1 锁式探针 PCR 产物的地高辛标记  34
    3.2.2 反向斑点杂交的特异性检测  34-35
    3.2.3 反向斑点杂交的灵敏度检测  35-36
4 结论与讨论  36-39
  4.1 结论  36-37
  4.2 锁式探针设计方面  37-38
  4.3 滚环扩增体系的优化  38
  4.4 反向斑点杂交  38-39
5 展望  39-40
参考文献  40-47
致谢  47

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