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中国桃褐腐病菌及其抗药性相关研究

作　者: 胡勐郡
导　师: 罗朝喜
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 桃褐腐病 种群结构 交配型 遗传多样性 抗药性
分类号: S432.44
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本研究第一次系统地描述了我国的桃褐腐病菌,确定了包括一个新种,一个新新记录种在内的三种桃褐腐病菌。克隆并分析了不同桃褐腐病菌的交配型位点,揭示了桃褐腐病菌为异宗配合真菌。此外,对我国广泛分布的美澳型核果褐腐病菌Moniliniafructicola进行了遗传多样性分析,并评估了其对QoI类杀菌剂产生抗药性的风险,最后筛选了一种适合利用M. fructicola菌株菌丝测定对SDHI杀菌剂敏感性的培养基,具体结果如下：1.通过对我国桃褐腐病菌生物学性状和对其ITS序列,微管蛋白(TUB2)以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)基因片段的测序分析,明确了我国的桃褐腐病菌共有3个种,分别是M. fructicola,新记录种Monilia mumecola,和新种Monilia yunnanensis sp. nov.。对ITS, TUB2和G3PDH的系统发育分析表明M. yunnanensis与欧洲最为普遍的桃褐腐病菌M. fructigena最为相近。有趣的是,M. yunnanensis和M. fructigena的Cyt b基因在内含子/外显子结构分布上差异明显。三种桃褐腐病菌中,M. fructicola在我国分布最广,从北京,山东,湖北,浙江,福建,陕西,甘肃以及云南等地的病桃上都分离到了M. fructicola, M. mumecola之前仅在日本的梅上分离到,本研究首次从湖北省桃上分离到该种。M. yunnanensis则是我们新发现的一个种,目前为止仅从云南,陕西等省分离到。同时设计了一个多重PCR检测方法,可快速鉴定我国桃褐腐病菌M. fructicola, M. mumecola和M. yunnanensis。2.克隆了桃褐腐病菌全部五个种的交配型位点,经过测序分析表明M.fructicola, M. fructigena, M. laxa, M. mumecola和M. yunnanensis菌株都为异宗配合真菌。在所有桃褐腐病原菌MAT1-1型菌株交配型位点上,包含一个MAT1-1-5基因和含有alpha-domain的MAT1-1-1基因,而MAT1-2型菌株交配型位点上则存在一个含HMG-domain的基因MAT1-2-1与MAT1-2-4。此外,M. yunnanensis的MAT1-2型菌株MAT1-2-4下游的非编码区中存在一段930bp的插入。进一步分析发现,所有MAT1-1型菌株交配型位点中都含有MAT1-2-1的部分片段,而MAT1-1型菌株的MAT1-1-1与MAT1-2型菌株的MAT1-2-4基因之间具有77.4%～91.8%的序列相似性(覆盖率为7.6%～27.8%)。利用不同桃褐腐菌株间’idiomorph’区域的差异,设计了三个特异性引物鉴定桃褐腐病菌全部五个种的交配型。进而根据PCR结果,选取了不同交配型的M. mumecola菌株和M. yunnanensis菌株分别同时接种桃,最后成功诱导出M. yunnanensis的子囊盘。3.利用RAPD技术对我国不同地区的M. fructicola菌株进行多样性分析,结果表明福建菌株遗传距离与其它菌群最远。Nei氏多样性指数和香农多样性指数表明北京的菌株群体的多样性最高。这些结果揭示了M. fructicola菌株可能早在2005年,其被首次报道以前就已经存在于我国。4.克隆并测序分析了M. fructicola菌株QoI类杀菌剂的靶标Cyt b基因,基因全长11927bp,包含7个长度为1592,1318,1166,1252,1065,2131和2227bp的内含子,分别位于其cDNA序列的第201,393,429,490,506,779和811位。其中,上述1166bp的内含子为Ⅰ型自剪切内含子,位于Cytb基因cDNA序列429位(氨基酸序列143位)。PCR扩增测序表明美国和中国的M. fructicola菌株Cytb基因143位点后都存在此内含子,预示着143位点的1166bp内含子是广泛存在的。虽然143位点发生突变(G143A)是植物病原菌抗QoIs的突变热点,但由于M.fructicola菌株普遍存在143位点的1166bp内含子,其产生G143A突变从而导致对QoIs高抗性的可能性极小。5.当使用富营养培养基(如PDA)测定M. fruticola菌丝对SDHI类杀菌剂的敏感性时,即使在含高浓度SDHIs的培养基中也不能完全抑制菌丝生长。而在所测试的培养基中,MM培养基不仅能使菌丝最快生长,而且在低浓度的SDHIs存在时,就能很好地抑制M. fructicola菌丝生长。MM培养基上,M. fructicola菌株对啶酰菌胺(boscalid),氟吡菌酰胺(fluopyram)和吡噻菌胺(penthiopyrad)的ECso分别为0.013～2.134μg/ml,0.059～15.557μg/ml,和0.0002～0.4582μg/ml三种SDHI类杀菌剂之间存在显著的交互抗性。

全文目录


摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
缩略词表  12-14
第一章 前言  14-34
  1.1 桃褐腐病的病原及危害  14-17
    1.1.1 病原,分布及寄主范围  14-15
    1.1.2 桃褐腐症状特征和发病条件  15-17
  1.2 桃褐腐病菌的鉴别  17-19
    1.2.1 培养性状  17
    1.2.2 分生孢子和芽管特征  17
    1.2.3 褐腐菌的分子鉴定  17-19
  1.3 桃褐腐病菌的防治  19-22
    1.3.1 防治问题概述  19
    1.3.2 农业防治  19
    1.3.3 生物防治  19-20
    1.3.4 化学防治  20-22
  1.4 桃褐腐病菌的抗药性分子机理  22-30
    1.4.1 桃褐腐病菌抗BZI类杀菌剂的分子机理  22-23
    1.4.2 桃褐腐病菌抗DCF类杀菌剂的分子机理  23-24
    1.4.3 桃褐腐病菌抗DMI类杀菌剂的分子机理  24-25
    1.4.4 病原真菌抗QoI类杀菌剂的分子机理  25-27
    1.4.5 病原真菌抗SDHI类杀菌剂的分子机理  27-30
  1.5 真菌交配型基因的研究  30-32
    1.5.1 有性生殖  30
    1.5.2 交配型基因  30-32
    1.5.3 褐腐菌有性生殖及交配型基因的研究  32
  1.6 论文研究目的与思路  32-34
第二章 我国桃褐腐病菌的种群结构研究  34-64
  2.1 引言  34-35
  2.2 材料与方法  35-45
    2.2.1 供试菌株  35-36
    2.2.2 主要实验仪器  36
    2.2.3 主要试剂及耗材  36
    2.2.4 相关培养基  36-38
    2.2.5 菌株的活化与培养  38
    2.2.6 基因组DNA的提取  38
    2.2.7 ITS序列扩增  38-39
    2.2.8 G3PDH和TUB2基因的扩增  39
    2.2.9 多重序列比对以及系统发育分析  39
    2.2.10 Cyt b基因的克隆与分析  39-40
    2.2.1 1桃褐腐菌落形态的观察  40-41
    2.2.12 菌落生长速度和产孢量的测定  41
    2.2.13 分生孢子的大小和形态观测  41
    2.2.14 致病性测定  41-42
    2.2.15 评价以PCR为基础的褐腐菌鉴定方法  42
    2.2.16 开发快速鉴定我国桃褐腐菌的PCR方法  42
    2.2.17 统计分析  42-45
  2.3 结果与分析  45-59
    2.3.1 内转录间隔区(ITS)1和2的分析  45-46
    2.3.2 G3PDH和TUB2基因的系统发育分析  46-50
    2.3.3 桃褐腐菌(Monilinia spp.)Cyt b基因序列的比较  50-51
    2.3.4 桃褐腐菌(Monilinia spp.)的培养性状  51-53
    2.3.5 菌落生长速度和产孢量  53
    2.3.6 分生孢子的大小及形态特点  53-55
    2.3.7 桃褐腐菌的致病性  55-56
    2.3.8 测试已有的PCR方法对桃褐腐菌的检测  56-58
    2.3.9 新的分子方法对我国桃褐腐菌的鉴定  58-59
  2.4 结论与讨论  59-64
第三章 桃褐腐菌交配型基因的分析  64-82
  3.1 引言  64-66
  3.2 材料与方法  66-69
    3.2.1 供试菌株  66-67
    3.2.2 主要实验仪器  67
    3.2.3 主要试剂及耗材  67
    3.2.4 相关培养基  67
    3.2.5 菌株的活化与培养  67
    3.2.6 基因组DNA的提取  67
    3.2.7 交配型基因的克隆  67-68
    3.2.8 序列分析  68
    3.2.9 褐腐菌交配型的鉴定  68-69
    3.2.10 诱导M.mumecola和M.yunnanensis形成子囊盘  69
  3.3 结果与分析  69-79
    3.3.1 褐腐菌交配型基因序列分析  69-74
    3.3.2 系统发育分析  74-76
    3.3.3 褐腐病菌交配型的鉴定  76-77
    3.3.4 诱导M.mumecola和M.yunnanensis的子囊盘  77-79
  3.4 结论与讨论  79-82
第四章 调查桃褐腐病菌M.fructicola的遗传多样性  82-89
  4.1 引言  82
  4.2 材料与方法  82-85
    4.2.1 供试菌株  82-83
    4.2.2 主要实验仪器  83
    4.2.3 主要试剂及耗材  83
    4.2.4 相关培养基  83-84
    4.2.5 引物  84
    4.2.6 菌株的活化与培养  84
    4.2.7 基因组DNA的提取  84
    4.2.8 随机多态性(RAPD)扩增  84
    4.2.9 RAPD图谱分析  84-85
  4.3 结果与分析  85-88
    4.3.1 随机引物的筛选  85
    4.3.2 用所选引物扩增得到的多态性条带  85-86
    4.3.3 多样性分析  86-87
    4.3.4 聚类分析结果  87-88
  4.4 结论与讨论  88-89
第五章 评价桃褐腐菌M.fructicola对QoI类杀菌剂的抗药性风险  89-104
  5.1 引言  89-90
  5.2 材料与方法  90-97
    5.2.1 供试菌株  90-91
    5.2.2 主要实验仪器  91
    5.2.3 主要试剂及耗材  91
    5.2.4 相关培养基  91
    5.2.5 菌株的活化与培养  91-92
    5.2.6 M.fructicola菌株对嘧菌酯的敏感性测定  92
    5.2.7 基因组DNA的提取  92-93
    5.2.8 基因组RNA的提取与cDNA的合成  93
    5.2.9 Cyt b基因的克隆  93-95
    5.2.10 调查1166 bp内含子在M.fructicola菌株中的分布情况  95
    5.2.11 统计分析  95-97
  5.3 结果与分析  97-101
    5.3.1 M.fructicola菌株对嘧菌酯的敏感性  97
    5.3.2 克隆M.fructicola菌株Cyt b基因的突变热点区域  97-99
    5.3.3 克隆Cyt b基因的整个cDNA序列  99-101
    5.3.4 克隆Cyt b基因突变热点区域的侧翼DNA序列  101
    5.3.5 G143位点后1166 bp内含子在其它菌株中的存在情况  101
  5.4 结论与讨论  101-104
第六章 M.fructicola对SDHI类杀菌剂敏感性测定的培养基筛选  104-113
  6.1 引言  104-105
  6.2 材料与方法  105-107
    6.2.1 供试药剂  105
    6.2.2 供试菌株  105-106
    6.2.3 主要实验仪器  106
    6.2.4 主要试剂及耗材  106
    6.2.5 相关培养基  106
    6.2.6 测定M.fructicola菌丝生长对SDHI类杀菌剂的敏感性  106
    6.2.7 药剂防治分析  106-107
    6.2.8 统计分析  107
  6.3 结果与分析  107-111
    6.3.1 筛选适合的培养基进行敏感性测定  107-108
    6.3.2 测定MM培养基上M.fructicola菌丝生长对SDHI类杀菌剂的敏感性  108-111
    6.3.3 SDHI杀菌剂在果实上的防效分析  111
  6.4 结论与讨论  111-113
第七章 全文总结与展望  113-117
  7.1 结论和创新点  113-115
    7.1.1 全文结论  113-114
    7.1.2 主要创新点  114-115
  7.2 研究展望  115-117
参考文献  117-138
附录  138-164
攻读博士学位期间发表的学术论文  164-166
致谢  166-167

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵（传）染性病害 > 真菌
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