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草鱼体内产纤维素酶菌株的筛选及其酶的分离纯化

作　者: 雷正瑜
导　师: 郝勃
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物
关键词: 筛选 纤维素酶 纯化 催化性质
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物，同时它也是地球上数量最大的可再生资源。利用微生物生产的纤维素酶将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料，对于人类社会解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。本课题利用刚果红选择平板与以不同的作用底物作碳源进行液态发酵直接测定酶活相结合的方法，从草鱼肠道内筛选出了一株能产纤维素酶的细菌菌株，并对筛得菌株的液态发酵产酶条件进行了研究，初步确定该菌株产酶的最佳培养条件为：初始pH值为7.0-7.3，接种量为5％（v／v），培养温度为37℃；最佳培养基为：1％（w／v）羧甲基纤维素钠（CMC-Na），1％（w／v）蛋白胨，0.1％（w／v）KH2PO4，0.5％（w／v）NaCL。在最佳培养条件下培养该菌株，对菌株液态培养的混合物，通过超声波破碎细胞壁、磁力搅拌菌体、离心过滤菌体等方法处理发酵液，检测并比较纤维素酶的酶活，确定了该菌株所产的酶为胞外酶。利用盐析、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析，Sephadex G-75凝胶过滤等方法得到纯化的酶，经过SDS-聚丙烯酰胺电泳检验，初步判定该酶为多亚基结构。对纯化后的纤维素酶的酶学性质进行了研究。以羧甲基纤维素作为底物时，该菌株所产纤维素酶的最适宜的催化温度为55℃，酶反应的温度范围较宽，在45℃-65℃的温度范围内，热稳定性良好，在80℃条件下仍残存有30％的酶活。最适宜的pH值为7.0，在4.0-7.0之间的pH值范围内，酶的活力较稳定。Mn2+、Mg2+对酶的活性有激活作用。Fe2+、Ca2+、Zn2+对酶的活性有抑制作用。Cu2+、Co2+有明显的毒害作用。以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为底物的Km值为5.3×10-3g／ml。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-9
第一部分 文献综述及技术路线  9-25
  1 纤维素  9-10
    1.1 纤维素的分子结构  9-10
    1.2 纤维素的降解  10
    1.3 用于研究纤维素水解的纤维素材料  10
  2 纤维素酶  10-15
    2.1 纤维素酶的组成与分类  10-11
    2.2 纤维素酶的分子结构  11-12
    2.3 纤维素酶的催化作用机制  12-13
    2.4 纤维素酶的理化性质  13-15
  3 产纤维素酶的微生物  15-16
  4 纤维素酶的分离纯化  16
  5 纤维素酶的研究进展  16-18
    5.1 国外研究概况  17
    5.2 国内研究概况  17-18
  6 纤维素酶的应用  18-22
    6.1 在食品加工和酿造工业上的应用  18-19
    6.2 在饲料工业上的应用  19-20
    6.3 在纺织工业上的应用  20
    6.4 在能源工业中的应用  20-21
    6.5 在环境保护和处理纤维素废料中的应用  21
    6.6 纤维素酶在医药工业中的应用  21-22
  7 纤维素酶在实际运用中的意义及问题  22-23
  8 本课题研究的主要内容及技术路线  23-25
    8.1 本课题研究的思路及意义  23-24
    8.2 技术路线  24-25
第二部分 实验研究部分  25-58
  第一节 草鱼肠道内产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究  25-39
    1 材料和方法  25-30
      1.1 材料  25
      1.2 培养基  25-26
      1.3 主要试剂及实验仪器  26-27
      1.4 方法  27-30
    2 结果与分析  30-36
      2.1 菌株的初筛  30-31
      2.2 菌种的复筛  31-32
      2.3 不同碳源对产酶的影响  32-33
      2.4 不同氮源对产酶的影响  33
      2.5 培养温度对产酶的影响  33-34
      2.6 培养基的初始pH值对产酶的影响  34
      2.7 发酵时间对产酶的影响  34-35
      2.8 种子培养时间对产酶的影响  35-36
      2.9 接种量对产酶的影响  36
    3 讨论  36-39
      3.1 纤维素酶活性的测定  36
      3.2 底物及酶液本身含糖量对结果的影响  36-37
      3.3 产纤维素酶菌株的筛选  37-38
      3.4 产酶条件的确定  38-39
  第二节 纤维素酶的分离纯化及其酶学性质的研究  39-58
    1 材料  39-40
      1.1 实验材料  39
      1.2 主要实验试剂  39-40
      1.3 主要仪器  40
    2 实验方法  40-46
      2.1 蛋白质标准曲线的绘制  40-41
      2.2 蛋白质浓度的测定  41
      2.3 粗酶液的的制备  41
      2.4 纤维素酶的细胞定位  41
      2.5 硫酸铵分级盐析初步提取纤维素酶  41-42
      2.6 透析脱盐  42
      2.7 DEAE-Sephadex A-50离子交换层析  42-43
      2.8 Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析  43-44
      2.9 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳  44-45
      2.10 反应温度对纤维素酶活力的影响和酶的热稳定性  45
      2.11 酶反应的最适pH值及酶的pH值稳定性  45-46
      2.12 纤维素酶Km的测定  46
      2.13 不同金属化合物对酶活力的影响  46
    3 结果与分析  46-55
      3.1 蛋白质标准曲线  46
      3.2 纤维素酶的细胞定位  46-47
      3.3 硫酸铵的分级沉淀  47
      3.4 DEAE-Sephadex A-50阴离子交换层析结果  47-48
      3.5 Sephadex G-75凝胶过滤  48-49
      3.6 酶的纯度鉴定  49-51
      3.7 纤维素酶的分离纯化结果  51-52
      3.8 反应温度对纤维素酶活力的影响和酶的热稳定性  52-53
      3.9 酶反应的最适pH值及pH稳定性  53-54
      3.10 纤维素酶Km的测定结果  54-55
      3.11 不同金属化合物对酶活力的影响  55
    4 讨论  55-58
      4.1 纤维素酶的细胞定位  55-56
      4.2 纤维素酶的分离纯化  56
      4.3 纤维素酶的SDS-PAGE  56-57
      4.4 酶学特性的研究  57-58
第三部分 基本结论和创新点  58-60
  1 基本结论  58
  2 本课题的主要创新点  58-60
参考文献  60-64
致谢  64

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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