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粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆及表达

作　者: 李洁琼
导　师: 喻子牛；郑世学
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 粘红酵母 ACC 染色体步移基因表达脂肪酸分析
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC)是脂肪酸合成代谢中的关键酶,它催化乙酰辅酶A生成丙二酰单酰辅酶A,后者是脂肪酸合成中二碳单位的供体,因此乙酰辅酶A羧化酶也成为脂肪酸合成代谢中的限速酶,被广泛应用于转基因油料作物研究中。本研究主要结果如下：利用简并PCR和染色体步移法首次克隆获得产油粘红酵母(Rhodotorula glutinis) ACC基因的全长序列信息。序列分析表明,该基因包含两个内含子,分别位于42-147 bp和315-677 bp处,编码区域总长为6801 bp,推导的氨基酸序列进行二级结构分析具备乙酰辅酶A羧化酶典型的三个功能域：生物素羧化酶(BC)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)和羧基转移酶(CT)。粘红酵母中ACC为多功能单亚基型酶,单体分子量在200 kD以上,从整体角度对编码该酶的基因进行异源表达十分困难,因此仿效多亚基型ACC的研究方法对粘红酵母ACC的功能域基因进行研究。本文分别利用两套原核表达体系pET-28a/BL21 (DE3)和pETDuet-1/Transetta (DE3)对粘红酵母ACC的三个功能域基因进行了独立表达和共表达,成功构建了9个表达载体。SDS-PAGE分析表明三个功能域基因在两套表达体系中均成功实现了单独表达,并且还实现了BC和CT两个功能域的共表达以及三个功能域的共表达。所有重组表达菌株利用水浴法抽提脂肪酸后进行气相色谱分析,结果如下：在pETDuet-1/Transetta (DE3)表达系统中,独立表达功能域BC或CT,共表达BC和CT二者及共表达BC、BCCP和CT三者获得的重组菌株较对照脂肪酸含量分别提高了15.4%、27.07%、35%、70.62%,只有单独表达功能域BCCP的重组菌株脂肪酸含量下降5.06%。而在pET-28a/BL21(DE3)表达体系中,重组表达菌株的脂肪酸含量较对照没有任何提高。由此证明在pETDuet-1/Transetta (DE3)表达系统中外源基因实现了功能性表达,BC和CT独立表达或共表达均能不同程度地提高脂肪酸含量,当三个功能域实现共表达时显著促进脂肪酸的积累。本研究还利用SOE-PCR去除了粘红酵母ACC基因内的两个内含子,并将ACC的cDNA全长分为三个片段：EK、KS、SX,依次连接到毕赤酵母表达载体pPICZaA上,构建了ACC全长表达载体,为后续真核表达和功能研究奠定基础。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
1前言  10-22
  1.1 植物油脂代谢研究  10-12
    1.1.1 饱和脂肪酸合成基因工程  11
    1.1.2 脂肪酸去饱和酶基因工程  11-12
    1.1.3 三酰甘油组装酶基因工程  12
  1.2 乙酰辅酶A羧化酶(ACC)简介  12-19
    1.2.1 ACC的分类  12-15
    1.2.2 ACC的生物学功能及表达调控  15-17
      1.2.2.1 动物组织中ACC的功能与应用  15-16
      1.2.2.2 植物组织中ACC的功能与应用  16-17
      1.2.2.3 微生物组织中ACC的功能与应用  17
      1.2.2.4 ACC的表达调控  17
    1.2.3 ACC抑制剂及机理研究  17-19
      1.2.3.1 动物ACC抑制剂及作用机理  17-18
      1.2.3.2 植物除草剂及作用机理  18
      1.2.3.3 其它类型ACC抑制剂及作用机理  18-19
  1.3 乙酰辅酶A羧化酶基因克隆及基因工程研究进展  19-21
    1.3.1 异质型ACC基因克隆及基因工程研究进展  19-20
    1.3.2 同质型ACC基因克隆及基因工程研究进展  20-21
  1.4 本研究的目的及意义  21-22
2 材料与方法  22-36
  2.1 材料  22-23
    2.1.1 菌株和质粒  22
    2.1.2 培养基  22
    2.1.3 主要仪器及试剂  22-23
      2.1.3.1 主要仪器  22
      2.1.3.2 主要试剂  22-23
  2.2 粘红酵母ACC基因的克隆  23-28
    2.2.1 引物设计、合成及测序  23-24
    2.2.2 粘红酵母基因组DNA的提取  24
    2.2.3 简并引物克隆ACC基因部分基因组DNA序列  24-25
    2.2.4 大肠杆菌E.coli DH5α感受态的制备  25
    2.2.5 转化  25-26
    2.2.6 阳性克隆子的筛选  26
    2.2.7 Genome walking酶切文库的构建  26
    2.2.8 Genome walking酶切文库连接Adaptors  26-27
    2.2.9 基于PCR的染色体步移法  27-28
  2.3 粘红酵母ACC三个功能域基因的独立表达  28-31
    2.3.1 粘红酵母总RNA的提取  28
    2.3.2 粘红酵母ACC三个功能域基因的克隆  28-29
    2.3.3 PCR产物的纯化  29-30
    2.3.4 重组质粒的抽提  30
    2.3.5 双酶切重组质粒  30
    2.3.6 切胶回收目的片段  30-31
    2.3.7 粘红酵母ACC三个功能域基因原核表达载体的构建  31
    2.3.8 转化宿主菌株  31
    2.3.9 目的蛋白的诱导表达  31
  2.4 粘红酵母ACC三个功能域基因的共表达  31-33
    2.4.1 共表达的三个功能域基因的克隆  31-32
    2.4.2 共表达载体的构建  32
    2.4.3 转化表达菌株  32-33
    2.4.4 目的蛋白的诱导表达  33
  2.5 重组表达菌株脂肪酸含量的测定  33-34
  2.6 粘红酵母ACC cDNA全长表达载体的构建  34-36
    2.6.1 粘红酵母ACC基因的编码区域的分段扩增  34-35
    2.6.2 毕赤酵母表达载体pPICZα-EK-KS-SX的构建  35-36
3 结果与分析  36-54
  3.1 粘红酵母ACC基因的克隆  36-38
    3.1.1 乙酰辅酶A羧化酶氨基酸序列的比对分析  36
    3.1.2 粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因部分序列的克隆  36-37
    3.1.3 基于PCR技术的染色体步移  37-38
  3.2 粘红酵母ACC三个功能域基因的独立表达  38-43
    3.2.1 粘红酵母总RNA的获得  38-39
    3.2.2 粘红酵母ACC三个功能域基因的克隆  39-40
    3.2.3 粘红酵母ACC三个功能域基因独立表达载体的构建及验证  40-42
    3.2.4 粘红酵母ACC三个功能域基因的独立表达  42-43
  3.3 粘红酵母ACC三个功能域基因共表达  43-50
    3.3.1 共表达载体的构建及验证  43-48
    3.3.2 SDS-PAGE电泳检测三个功能域基因的共表达  48-50
  3.4 脂肪酸分析  50-52
  3.5 粘红酵母ACC cDNA全长表达载体的构建  52-54
4 讨论  54-57
  4.1 长片段未知基因的克隆  54-55
  4.2 不同表达条件对蛋白活性的影响  55
  4.3 粘红酵母ACC三个功能域基因对脂肪酸合成的影响  55-57
5 总结与展望  57-58
  5.1 总结  57
  5.2 展望  57-58
参考文献  58-66
致谢  66-67
攻读硕士学位期间已发表的论文  67

粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆及表达

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