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浓香型大曲制备过程中理化指标及微生物群落演替规律的研究

作　者: 李丹宇
导　师: 罗惠波
学　校: 四川理工学院
专　业: 发酵工程
关键词: 大曲理化指标生化指标 PCR-DGGE 微生物多样性相关性分析
分类号: TS261.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

大曲在中国浓香型白酒生产过程中起着重要作用。为了全面了解大曲培菌、储藏期间微生物群落的演替规律及相互作用,及其与大曲各项指标之间的相关性,特别是大曲微生物群落的功能及多酶体系。本试验以泸州老窖浓香型中温大曲不同发酵阶段共12个样品为研究对象,采用连续流动化学分析仪和PCR-DGGE技术,对发酵过程中大曲理化、生化指标变化规律和微生物群落多态性进行研究,主要研究结论如下：1.大曲发酵过程中,理化、生化指标处于不断的变动的状态,表明微生物代谢关系的复杂性。数据分析结果表明：①大曲培菌期间,总酸、还原糖含量先升后降,进入储藏期有所回升,之后缓慢下降；氨基酸含量,一直保持上升趋势,进入储藏期增加趋势缓慢；淀粉含量在培菌期持续下降,第20d降至最低,后期检出量略有回升。②大曲培菌期间,糖化力、液化力、酯化力均呈先增后降趋势,其中糖化力下降幅度最大,进入储藏期三者均有回升,储藏后期均稳定在较高水平；而蛋白分解力,整体呈先升后降的趋势,第40d达到最大值,之后缓慢下降。2.大曲微生物群落PCR-DGGE图谱分析表明：①在整个发酵过程中,大曲真菌、酵母群落的条带丰度值及优势度差异较大,变化频繁,菌群结构存在演替现象。其中真菌、酵母图谱分别出现7-17、5-16条清晰条带,整体来看,大曲经培菌、储减真菌和酵母种类、数量不断积累。②在整个过程中大曲原核微生物种群结构变化也较大,图谱中出现7-17条清晰条带,多样性指数呈波浪式上升趋势,并最终形成稳定的细菌群落区系。3.大曲发酵过程中理化、生化指标间的相关性分析表明：总酸与还原糖呈显著正相关性；还原糖与糖化力呈正相关；氨基酸与蛋白分解力、酯化力、液化力呈显著正相关,而与淀粉含量呈显著负相关；糖化力与酯化力呈显著正相关性；酯化力、液化力、蛋白分解力三者之间均呈极显著的正相关性,表明微生物代谢关系的复杂性及综合性和特殊性。4.发酵过程中理化、生化数据与大曲群落的相关性分析结果表明：①大曲发酵过程中真菌、酵母多样性与总酸、还原糖、淀粉含量呈负相关,其中酵母与总酸的相关系数为-0.58,呈较强负相关性,说明酵母生长受总酸含量影响较大：糖化力、液化力、蛋白分解力与真菌呈极显著相关或显著相关,说明真核微物对大曲生化酶类的生成有重要作用；酯化力、蛋白分解力与酵母显著相关,说明酵母对大曲复合香味物质的生成发挥重要作用。②细菌除与还原糖、淀粉含量呈负相关外,与其他大曲指标均呈正相关。其中总酸含量与细菌多样性指数的相关系数为0.82,呈极显著相关,蛋白分解力与细菌多样性指数呈显著相关。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-15
1 绪论  15-24
  1.1 白酒酿造用大曲的概述  15-16
    1.1.1 大曲简介  15
    1.1.2 大曲种类及功能  15-16
  1.2 大曲的组分  16-17
    1.2.1 大曲中的物质和酶系  16
    1.2.2 大曲中的微生物区系  16-17
  1.3 大曲研究概况  17-20
    1.3.1 大曲质量的研究进展  17
    1.3.2 大曲微生物区系研究进展  17-20
  1.4 连续流动分析仪的发展和应用  20
  1.5 PCR-DGGE技术及其在微生物生态学研究中的应用进展  20-22
    1.5.1 分子生态学的研究技术  20-21
    1.5.2 PCR-DGGE技术  21
    1.5.3 PCR-DGGE技术在微生物群落结构中的研究进展  21-22
  1.6 本论文研究的目的、内容、技术路线  22-24
    1.6.1 研究的目的和意义  22
    1.6.2 研究内容  22
    1.6.3 技术路线  22-24
2 大曲发酵过程中理化、生化指标的测定  24-42
  2.1 试验材料  24-25
    2.1.1 试验材料  24
    2.1.2 主要试剂  24
    2.1.3 主要仪器  24-25
    2.1.4 仪器参数设定  25
  2.2 实验方法  25-30
    2.2.1 大曲发酵温度和水分含量的测定  25
    2.2.2 大曲淀粉含量的测定  25-26
      2.2.2.1 试剂配制  25
      2.2.2.2 高氯酸萃取淀粉条件的优化  25-26
      2.2.2.3 淀粉测定流程图  26
    2.2.3 酸度测定  26-27
      2.2.3.1 总酸测定试剂及标品配制  26
      2.2.3.2 总酸测定的样品前处理  26
      2.2.3.3 总酸含量计算公式  26-27
      2.2.3.4 总酸测定流程图  27
    2.2.4 还原糖等测定  27-28
      2.2.4.1 大曲还原糖测定试剂及标品配制  27
      2.2.4.2 大曲样品的预处理  27
      2.2.4.3 还原糖测定流程图  27-28
    2.2.5 大曲游离氨基氮的测定  28
      2.2.5.1 大曲游离氨基酸测定试剂及标品配制  28
      2.2.5.2 游离氨基酸测定的样品前处理  28
    2.2.6 大曲糖化力的测定  28-29
      2.2.6.1 试剂配制  29
      2.2.6.2 糖化力测定的样品前处理  29
      2.2.6.3 糖化力测定流程图  29
    2.2.7 液化力的测定  29-30
    2.2.8 蛋白酶活力测定  30
  2.3 结果与分析  30-40
    2.3.1 大曲培菌期、储藏期间的温度、水分的变化  30-31
    2.3.2 高氯酸/乙醇萃取淀粉条件的优化  31-32
    2.3.3 制曲期间淀粉、总酸、还原糖、游离氨基酸含量的变化规律  32-35
      2.3.3.1 淀粉、总酸、还原糖、游离氨基酸测定标准曲线  32-34
      2.3.3.2 制曲期间淀粉、总酸、还原糖、游离氨基酸的变化规律  34-35
    2.3.4 制曲期间糖化力和液化力的变化规律  35-37
      2.3.4.1 糖化力测定标准曲线  35-36
      2.3.4.2 制曲期间糖化力的变化规律  36-37
    2.3.5 制曲期间液化力的变化规律  37
    2.3.6 制曲期间酯化力的变化规律  37-38
    2.3.7 制曲期间蛋白酶活力的变化规律  38-40
      2.3.7.1 蛋白分解力测定标准曲线  38-39
      2.3.7.2 制曲期间蛋白酶活力的变化规律  39-40
  2.4 本章小结  40-42
3 大曲发酵过程中微生物群落结构的变化  42-63
  3.1 材料与方法  42-47
    3.1.1 试验材料  42
    3.1.2 主要试剂及器材  42-43
      3.1.2.1 试剂  42-43
      3.1.2.2 仪器设备  43
      3.1.2.3 试剂的配制  43
    3.1.3 大曲微生物总DNA的提取  43-44
    3.1.4 DNA质量检测  44
    3.1.5 PCR扩增  44-46
      3.1.5.1 PCR扩增程序  45
      3.1.5.2 PCR扩增引物  45-46
    3.1.6 DGGE  46
      3.1.6.1 灌制变性梯度凝胶  46
      3.1.6.2 电泳  46
    3.1.7 分析方法  46-47
  3.2 浓香型大曲真菌群落结构变化规律的解析  47-56
    3.2.1 基因组DNA的提取  47
    3.2.2 真菌18SrDNA电泳条件及引物的选择  47-49
    3.2.3 大曲真菌群落结构18SrDNA基因DGGE图谱分析  49-55
      3.2.3.1 大曲真菌DGGE图谱丰度的变化规律  49-51
      3.2.3.2 大曲真菌DGGE图谱主要条带优势度变化规律  51-53
      3.2.3.3 大曲真菌DGGE图谱多样性指数变化规律  53
      3.2.3.4 大曲真菌DGGE图谱相似性指数及聚类分析  53-55
    3.2.4 小结  55-56
  3.3 浓香型大曲酵母群落结构变化规律的解析  56-63
    3.3.1 不同发酵阶段大曲样品酵母26SrDNA D1区基因  56
    3.3.2 大曲酵母26SrDNA D1区基因DGGE电泳  56-57
    3.3.3 大曲酵母26SrDNA D1区基因DGGE图谱分析  57-62
      3.3.3.1 大曲酵母DGGE图谱丰度分析  57-58
      3.3.3.2 大曲酵母DGGE图谱主要条带优势度的分析  58-59
      3.3.3.3 大曲酵母DGGE图谱多样性指数分析  59-61
      3.3.3.4 大曲酵母DGGE图谱相似性指数  61-62
    3.3.4 小结  62-63
4 浓香型大曲细菌群落结构变化规律的解析  63-71
  4.1 材料与方法  63
    4.1.1 试验材料  63
    4.1.2 主要试剂及器材  63
    4.1.3 基因组DNA的提取  63
  4.2 浓香型大曲细菌群落结构变化规律的解析  63-71
    4.2.1 大曲细菌16SrDNA V6-V8区基因的获取  63-64
    4.2.2 大曲细菌16SrDNA V6-V8区基因DGGE电泳  64
    4.2.3 大曲细菌16SrDNA V6～V8区基因DGGE图谱分析  64-69
      4.2.3.1 大曲细菌DGGE图谱丰度值分析  64-65
      4.2.3.2 大曲细菌DGGE图主要条带优势度的变化规律  65-67
      4.2.3.3 大曲细菌DGGE图谱多样性指数变化规律  67
      4.2.3.4 大曲细菌DGGE图谱相似性指数  67-69
    4.2.4 讨论  69-70
    4.2.5 小结  70-71
5 大曲发酵过程中微生物及理化生化指标的相关性分析  71-74
  5.1 大曲发酵过程中理化、生化指标的相关性分析  72
  5.2 大曲发酵过程中真菌、酵母、细菌微生物群落间相关性分析  72
  5.3 大曲发酵过程中真菌、酵母菌群落与理化、生化指标的相关性  72-73
  5.4 大曲发酵过程中细菌群落与理化、生化指标的相关性  73
  5.5 小结  73-74
6 结论与展望  74-76
  6.1 结论  74-75
  6.2 展望  75-76
参考文献  76-81
攻读学位期间发表的学术论文及研究成果  81-82
致谢  82

浓香型大曲制备过程中理化指标及微生物群落演替规律的研究

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