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阿氏丝孢酵母（Trichosporon asahii）β-葡萄糖苷酶及葡萄糖苷类风味物质水解机制的研究

作　者: 王玉霞
导　师: 李记明; 徐岩
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: β-葡萄糖苷酶风味糖苷前体高葡萄糖耐受性低pH抗性蛋白二级结构色素糖苷水解
分类号: TS262.6
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)，是一类能催化芳基糖苷、烷基糖苷、纤维素和纤维低聚糖等糖链末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键水解以释放出糖配体的水解酶，在葡萄酒糖苷类风味前体的水解中起着非常重要的作用。葡萄酒在我国各类果酒中占有不可替代的主导地位，由于目前葡萄酒酿造专用β-葡萄糖苷酶的缺乏，在很大程度上影响了葡萄酒风味的全面提升和改善。富含β-葡萄糖苷酶制剂在葡萄酒风味提升中的使用受许多因素限制而无法普及，从而使得以风味为导向的β-葡萄糖苷酶研究成为葡萄酒品质提升研究的热点和难点。我国的葡萄酒起步较晚，虽然生产和销售都逐年攀升，但与老牌的外国葡萄酒相比还有很长的路要走。品质和风格见长的洋酒使中国成为它们竞相争夺的市场。将性能优良的β-葡萄糖苷酶与品质有待提升、风格极需体现的中国葡萄酒结合的尝试，不但可以丰富我国葡萄酒酿造与风味研究的理论，还为实际应用提供有价值的指导。基于我国葡萄酒产业风味酶研究与应用现状，从我国著名葡萄酒生产企业张裕集团有限公司，胶东半岛葡萄酒生产基地进行采样分离筛选具优良特性的β-葡萄糖苷酶。主要结论如下：(1)针对高糖低pH的葡萄醪特性，对β-葡萄糖苷酶产生菌进行筛选。共分离到了10种酵母，有4种能检测到β-葡萄糖苷酶活力的存在。其中阿氏丝孢酵母(Trichosporonasahii)F6菌株的β-葡萄糖苷酶活力最高，目前这是此种属酵母菌产β-葡萄糖苷酶的首次报道。针对影响酶活力的主要葡萄酒酿造相关因子(糖、pH、醇)，F6菌株的β-葡萄糖苷酶与实验中其它菌株的β-葡萄糖苷酶的抗性进行比较，同时测试对糖苷提取物的水解情况。结果显示，F6菌株的β-葡萄糖苷酶具有较强的低pH耐受性，同时对糖苷提取物表现出显著优于其它种属酵母β-葡萄糖苷酶的水解效果。这些结论显示出了F6菌株β-葡萄糖苷酶优良的应用潜能。(2)应用发酵技术对F6菌株产酶培养基进行优化及纯酶的性质研究。培养基优化策略使产酶量较初始的YPD培养基提高了1.74倍，达到了0.216U/mL。F6菌株发酵上清液，经过硫铵沉淀、苯基疏水柱等纯化步骤较顺利地得到F6菌株β-葡萄糖苷酶的两个电泳纯的同功酶(BG1和BG2)，它们的分子量分别为160kDa和30kDa；BG1的动力学参数显示对pNPG的亲和性和催化效率都远大于BG2；而且BG1在pH和温度耐受方面都显示出优于BG2的特性；BG1还展示出对SDS和β-巯基乙醇的抗性，后者显示BG1活性中心没有二硫键。BG1比BG2优良的许多抗性源于其圆二色谱揭示高比例的β-折叠结构，即富β-折叠结构蛋白具有较高的动力学稳定特性。除此之外，BG1还具有以葡萄糖或纤维二糖为底物合成低聚寡糖的转糖苷能力。这些性能显示BG1具有较宽的工业应用范围和潜在应用价值。(3) F6菌株纯酶(BG1)与商业酶香气释放能力比较及对葡萄酒颜色的影响。分别将BG1与黑曲霉和杏仁的β-葡萄糖苷酶(AS, Al)应用于同一葡萄品种糖苷提取物水解，以及加入葡萄醪中经历发酵过程，以考察对糖苷形式存在的风味前体的水解情况。结果显示在糖苷提取物水解实验中，三个酶各自表现出对不同类前体物质的水解差异。酶BG1对萜类、部分醛酮和醇类物质的前体表现出显著高于其它酶的水解能力；经历发酵过程后，三个酶都表现出明显差于在糖苷提取物水解条件下对风味物质的释放效果。与两个商业酶相比，BG1表现出了较为优越的在葡萄酒酿造条件下水解风味前体释放香气成分的能力。此外，在蛇龙珠葡萄酒中主要呈色糖苷类物质malvidol-3-glucoside、malvidol-3-acetylglucoside和malvidol-3-coumarylglucosid中，三个酶都有不同程度的水解作用，其中BG1酶的水解程度最小，Al酶其次，AS酶水解程度最大。此结果显示出BG1在保持酒体色泽方面显著优于商业酶的性能。(4)糖苷类风味物质水解差异机制的探讨。葡萄酒酿造过程中存在抑制或使酶失活的因素，且对参试各酶的活力抑制或失活的程度不同。在不同浓度葡萄糖和不同pH条件下的蛋白二级结构和酶活变化情况显示，葡萄糖施加的是可逆的产物抑制过程，在去除葡萄糖后，酶的活力得以恢复。此外葡萄糖对三个酶的活力抑制的程度不同，其中AS酶对葡萄糖极为敏感，随着葡萄糖浓度的增加，酶活力急剧下降，AS酶的蛋白结构中α-螺旋、β-折叠比例下降而无规则卷曲结构比例的迅速增加。低pH对所有酶的活力都有较强的抑制作用，随着pH的下降，抑制作用变强，但BG1在三个酶中的对低pH耐受性最强。与葡萄糖对酶活力的抑制不同，低pH的抑制作用对酶是一种不可逆的损伤。pH对三个酶二级结构的影响显现出相似的趋势，即随着pH的降低，蛋白α-螺旋、β-折叠含量下降，而表征变性的无规则卷曲结构比例增加。BG1耐葡萄糖、抗低pH特性，源于其蛋白结构中含量较少的α-螺旋结构和富β-折叠结构，这也使其更具有在葡萄酒酿造条件下的应用前景。此课题的结果证实，筛选得到的F6菌株的β-葡萄糖苷酶(BG1)，其多方面的性能都优于来自黑曲霉和杏仁的β-葡萄糖苷酶。如高糖、低pH耐受性，尤其是对葡萄中存在的主要色素物质水解率极低而表现出对酒体色泽的保持作用。课题还就F6菌株的β-葡萄糖苷酶与商业β-葡萄糖苷酶，在糖苷提取物水解条件与真实酿酒环境下水解糖苷前体能力差异的机理进行了探讨。因此，本论文不但为葡萄酒产业提供了风味提升关键酶的酶源，更为其应用提供了丰富的理论和实践指导。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-11
第一章绪论  11-22
  1.1 葡萄酒香气  11-12
  1.2 糖苷类风味物质研究  12-13
    1.2.1 糖苷类风味物质  12
    1.2.2 结合态风味物质的研究  12-13
  1.3 糖苷类物质的水解机制及关键酶  13-17
    1.3.1 葡萄酒风味改良中的酶技术  14-15
    1.3.2 β-D-葡萄糖苷酶的来源  15-17
  1.4 β-葡萄糖苷酶的应用  17
  1.5 β-葡萄糖苷酶在葡萄酒风味提升中存在的问题和研究的意义  17-20
    1.5.1 存在的问题  17-19
    1.5.2 研究目的与意义  19-20
  1.6 本研究的思路和内容  20-22
第二章酵母β-葡萄糖苷酶产生菌分离及其水解糖苷特性分析  22-41
  2.1 前言  22-23
  2.2 材料与方法  23-28
    2.2.1 采样  23
    2.2.2 主要试剂与仪器  23
    2.2.3 培养基与菌种保存  23
    2.2.5 方法  23-28
  2.3 结果与讨论  28-40
    2.3.1 酵母菌分离  28
    2.3.2 酵母菌分子鉴定  28-30
    2.3.3 各种属酵母菌出现频次调查  30-31
    2.3.4 各种属酵母β-葡萄糖苷酶活力调查  31
    2.3.5 酶的定位  31-32
    2.3.6 高糖、低 pH、乙醇条件下产酶情况  32-36
    2.3.7 胁迫对各菌株粗酶活力的影响  36-39
    2.3.8 不同酵母β-葡萄糖苷酶对结合态前体水解的影响  39-40
  2.4 本章小结  40-41
第三章阿氏丝孢酵母(Trichosporon asahii, F6)产β-葡萄糖苷酶发酵过程研究  41-52
  3.1 前言  41
  3.2 材料与方法  41-43
    3.2.1 菌种与培养基  41
    3.2.2 主要试剂与仪器  41-42
    3.2.3 研究方法  42-43
  3.3 结果与讨论  43-50
    3.3.1 培养基初始 pH  43
    3.3.2 装液量  43-44
    3.3.3 氮源  44
    3.3.4 碳源  44-45
    3.3.5 无机盐  45
    3.3.6 PB design  45-46
    3.3.7 最陡爬坡实验  46-47
    3.3.8 CCD  47-50
    3.3.9 验证  50
  3.4 本章小结  50-52
第四章阿氏丝孢酵母β-葡萄糖苷酶酶学性质研究  52-67
  4.1 前言  52
  4.2 材料与方法  52-55
    4.2.1 菌种与培养基  52
    4.2.2 主要试剂与仪器  52-53
    4.2.3 缓冲液  53
    4.2.5 研究方法  53-55
  4.3 结果与讨论  55-65
    4.3.1 F6 菌株β-葡萄糖苷酶的纯化  55-57
    4.3.2 酶的动力学参数  57-58
    4.3.3 最适 pH 及 pH 稳定性  58-59
    4.3.4 酶的最适温度及耐热性  59-60
    4.3.5 酶对金属离子和化学试剂的敏感性  60-62
    4.3.6 酶的底物特异性  62
    4.3.7 酶的二级结构圆二色谱分析  62-64
    4.3.8 酶的转糖苷特性  64-65
  4.4 本章小结  65-67
第五章阿氏丝孢酵母β-葡萄糖苷酶(BG1)耐受性考察及在新葡萄酒中的应用  67-76
  5.1 前言  67
  5.2 材料与方法  67-68
    5.2.1 菌种与酶  67
    5.2.2 主要试剂与仪器  67
    5.2.5 研究方法  67-68
  5.3 结果与讨论  68-75
    5.3.1 糖对β-葡萄糖苷酶活力的影响  68-70
    5.3.2 醇对酶活力的影响  70-72
    5.3.3 不同酸与 pH 对酶活力的影响  72-73
    5.3.4 酶处理对葡萄酒风味的影响  73-74
    5.3.5 主成分分析(PCA)  74-75
  5.4 本章小结  75-76
第六章阿氏丝孢酵母β-葡萄糖苷酶在酿造中的应用及水解机制探讨  76-95
  6.1 前言  76
  6.2 材料与方法  76-77
    6.2.1 菌种与试材  76
    6.2.2 主要试剂与仪器  76
    6.2.3 研究方法  76-77
  6.3 结果与讨论  77-93
    6.3.1 不同β-葡萄糖苷酶对蛇龙珠糖苷提取物和葡萄酒风味的影响  77-79
    6.3.2 挥发性成分的主成分分析  79-83
    6.3.3 偏好性感官评价  83-84
    6.3.4 酶对色素含量的影响  84-87
    6.3.5 不同浓度葡萄糖和 pH 对酶二级结构与活力的影响  87-90
    6.3.6 不同 pH 对酶二级结构与活力的影响  90-93
  6.4 本章小结  93-95
结论与展望  95-98
  主要结论  95-97
  研究展望  97-98
论文创新点  98-99
致谢  99-100
参考文献  100-114
附录：(图)表  114-128
附录：作者攻读博士学位期间发表的论文  128

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