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酵母菌生产海藻糖的研究

作　者: 安宁
导　师: 张伟国
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 海藻糖酿酒酵母育种发酵优化
分类号: TS245
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本文对酵母菌产海藻糖的测定方法、菌株选育及发酵条件等方面进行了研究。主要内容和结果如下：(1)从实验室保藏的酿酒酵母中筛选得到一株产海藻糖较高的菌株SC2，测得其胞内海藻糖含量为48mg/g干重。随后对菌株SC2的破壁方法进行了研究，结果表明，最佳的破壁方法为高温干热法。采用该方法破壁，对酵母提取液中海藻糖的定量方法进行研究，发现DNS-蒽酮硫酸法具有较高的可信度。(2)以菌株SC2为出发菌，通过紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)逐级诱变处理，并采用NaCl、高糖和乙醇梯度平板进行定向筛选，得到突变株SA12，其胞内海藻糖含量为64mg/g干重，比出发菌株SC2胞内海藻糖含量提高了33%。(3)对突变株SA12的种子培养基和培养条件进行了优化，确定了最佳种子培养基成分：葡萄糖40g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO43g/L；最佳培养条件：初始pH5.5，装液量80mL/500mL三角瓶。并对其发酵培养基及培养条件进行了优化，确定了最佳发酵培养基成分：葡萄糖81g/L，玉米浆52g/L，酵母膏1g/L，K2HPO40.9g/L，NaH2PO41.5g/L， MgSO4·7H2O0.26g/L；最佳培养条件：初始pH5.5，装液量100mL/500mL三角瓶，种龄12h。突变株SA12在优化条件下发酵72h，胞内海藻糖含量达到149mg/g干重，对应产量为3.1g/L。(4)对菌株SA12进行条件胁迫研究。NaCl高渗胁迫时，发现发酵进行到46h时，添加40g/L NaCl，最终酵母胞内海藻糖含量达到227mg/g干重，比未经盐胁迫时的胞内海藻糖含量提高了52%，对应产量为4.82g/L。乙醇胁迫时，发现在对数生长后期添加2%～10%(v/v)的乙醇，并没有提高酵母胞内海藻糖含量，相反随着添加浓度的增高，海藻糖含量逐渐降低。温度胁迫时，发现在67h、68h和69h时分别采用37℃、39℃和41℃进行热激，胞内海藻糖含量均提高了12%，热激温度越高，所用热激时间越短。(5)对菌株SA12进行补料分批发酵条件的初步研究，结果如下：最佳初糖浓度为40g/L；最佳补糖时间为12h；相对溶氧控制策略为0～16h控制在20%～30%，16～72h控制在0～10%。采用优化后的发酵条件和NaCl胁迫方式对该菌进行7L发酵罐初步发酵试验，最终生物量为23.3g/L，胞内海藻糖含量为229mg/g干重，产量为5.4g/L。(6)应用Logistic模型、DoseResp模型、Boltzmann模型和SGompertz模型对分批发酵过程中的菌体生长、底物消耗和产物形成的实验数据进行非线性拟合并建立相应的动力学模型，所得拟合模型基本反映了海藻糖的分批发酵过程。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章引言  8-20
  1.1 前言  8
  1.2 海藻糖的理化性质  8
  1.3 海藻糖的生物学特性及其生理功能  8-10
  1.4 海藻糖对生物质保护作用的机理  10-11
  1.5 海藻糖的应用  11-14
  1.6 海藻糖的生物合成途径  14-15
  1.7 海藻糖的生产方法  15-17
  1.8 酵母生产海藻糖的研究概况  17-18
  1.9 本论文的立题背景与研究意义  18
  1.10 本论文的研究内容  18-20
第二章材料与方法  20-26
  2.1 实验材料  20-21
    2.1.1 出发菌株  20
    2.1.2 主要试剂和仪器  20-21
    2.1.3 培养基  21
  2.2 方法  21-26
    2.2.1 培养方法  21
    2.2.2 诱变方法  21-22
    2.2.3 平板筛选方法  22
    2.2.4 摇瓶筛选方法  22-23
    2.2.5 酿酒酵母破壁方法  23
    2.2.6 测定方法  23-26
第三章结果与讨论  26-58
  3.1 酿酒酵母中海藻糖的破壁提取方法的研究  26-28
    3.1.1 酿酒酵母破壁方法的选择  26-27
    3.1.2 高温破壁时间和温度的优化  27-28
  3.2 海藻糖的定性定量分析  28-31
    3.2.1 纸层析结果  28-29
    3.2.2 HPLC测糖结果  29-31
    3.2.3 DNS-蒽酮硫酸法测海藻糖的研究  31
  3.3 海藻糖高产菌的选育  31-37
    3.3.1 种子生长曲线的测定  31-32
    3.3.2 诱变时间的确定  32-33
    3.3.3 海藻糖产生菌的选育结果  33-36
    3.3.4 海藻糖产生菌的选育谱系  36
    3.3.5 菌株SA12 遗传稳定性研究  36-37
  3.4 摇瓶培养条件的优化  37-47
    3.4.1 种子培养基及培养条件的优化  37-39
    3.4.2 SA12 酵母菌株发酵生产海藻糖过程曲线  39
    3.4.3 海藻糖摇瓶发酵培养基的优化  39-43
    3.4.4 发酵培养基的响应面(RSM)分析实验  43-45
    3.4.5 发酵条件的优化  45-47
  3.5 胁迫诱导条件对酿酒酵母菌体生长和海藻糖生物合成的影响  47-51
    3.5.1 NaCl对酿酒酵母菌体生长和海藻糖生物合成的影响  48-49
    3.5.2 乙醇对酿酒酵母菌体生长和海藻糖生物合成的影响  49-50
    3.5.3 高温对酿酒酵母菌体生长和海藻糖生物合成的影响  50-51
  3.6 补料分批发酵的研究  51-54
    3.6.1 最适初糖浓度的确定  51-52
    3.6.2 最适补糖时间的确定  52
    3.6.3 溶氧对酿酒酵母产海藻糖的影响  52-53
    3.6.4 7L罐补料分批发酵产海藻糖的研究  53-54
  3.7 分批发酵动力学研究  54-56
    3.7.1 菌体生长模型  54-55
    3.7.2 底物消耗模型  55
    3.7.3 产物形成模型  55-56
  3.8 结论  56-57
  3.9 课题展望  57-58
参考文献  58-64
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  64

酵母菌生产海藻糖的研究

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