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一步法生产尸胺谷氨酸棒杆菌基因工程菌的构建及发酵条件的优化

作　者: 牛涛
导　师: 黎明
学　校: 天津科技大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 赖氨酸脱羧酶 谷氨酸棒杆菌 尸胺
分类号: TQ922.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


18世纪工业革命以来,石油资源的大量消耗导致大气CO2含量的迅速升高。而CO2含量的升高促成了全球气候变暖。使用可再生资源生产聚合物成为解决这一问题的方法之一。每年全世界大约生产1,200,000吨聚酰胺,其中尼龙-6和尼龙-66约占90%。如果我们能用可再生资源来生产聚酰胺,这将能有效遏制全球气候变暖。尼龙66是由己二胺和己二酸1：1聚合生成。尸胺(1,5-戊二胺)是赖氨酸脱羧的产物,它的结构与己二胺非常相似,可以替代由石油制备的己二胺,已有技术可以将尸胺精炼后和己二酸工具合成具有实用性的尼龙-56,尼龙-56是一种耐高温的新型塑料。为使谷氨酸棒杆菌能生产尸胺,必须要在谷氨酸棒杆菌细胞内表达外源赖氨酸脱羧酶基因。本研究在前期工作的基础上,以蜂房哈夫尼菌Hafnia alveiAS1.1009基因组为模板,通过PCR扩增,得到大小约为2.2kb的赖氨酸脱羧酶基因ldc。以大肠杆茵/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19为载体,将扩增得到的目的基因片段克隆至C. glutamicum TK260512,获得重组菌株C. glutamicum TK260512/pXMJ19-ldc。重组菌株经IPTG在30℃诱导后,SDS-PAGE结果显示赖氨酸脱羧酶基因得到了表达,它编码的蛋白质分子量为83kD。利用250mL三角瓶发酵,对重组菌株C. glutamicum TK260512/pXMJ19-ldc的尸胺发酵条件进行了优化,确定了进行摇瓶发酵的合成培养基配方及培养条件。(1)培养基：葡萄糖11%、(NH4)2SO44%,豆饼水解液5%,CH3COOH0.6%, K2HPO42.5g/L, MgSO4·7H2O0.75g/L, CaCl2·2H2O50mg/L, FeSO4·7H2O50mg/L, MnSO4·5H2O13mg/L,烟酸14mg/L,硫胺素盐酸盐7mg/l,生物素0.5mg/l,磷酸吡哆醛0.5mg/L (pH7.0)。(2)接种量：8%(3)装液量：30ml/250mL三角瓶(4)震荡频率：200r/min重组菌株C. glutamicum TK260512/pXMJ19-ldc在上述培养基和培养条件下经36h发酵,尸胺最终产量达到2.52g/L,比优化前提高了83%。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
1 前言  9-21
  1.1 尸胺简介  9-14
    1.1.1 尸胺的性质  9
    1.1.2 尸胺的生物学作用  9-11
    1.1.3 新型耐高温塑料尼龙-56  11-12
    1.1.4 尸胺的生产方法  12-14
  1.2 L-赖氨酸脱羧酶  14-16
    1.2.1 L-赖氨酸脱羧酶性质和来源  14-15
    1.2.2 L-赖氨酸脱羧酶酶活测定方法  15-16
  1.3 谷氨酸棒杆菌表达体系  16-19
    1.3.1 棒杆菌载体系统的研究  16-18
    1.3.2 转化技术  18-19
  1.4 论文立题背景及主要内容  19-21
    1.4.1 立题背景  19-20
    1.4.2 本课题研究内容  20-21
2 材料与方法  21-36
  2.1 实验材料  21-24
    2.1.1 菌株与质粒  21
    2.1.2 试剂  21-22
    2.1.3 溶液  22-23
    2.1.4 培养基和抗生素  23-24
    2.1.5 仪器  24
  2.2 实验方法  24-36
    2.2.1 Hafnia alvei染色体的提取  24-25
    2.2.2 琼脂糖凝胶电泳  25
    2.2.3 基因克隆  25-27
    2.2.4 克隆载体的构建与鉴定  27-29
    2.2.5 表达载体的构建与鉴定  29-30
    2.2.6 谷氨酸棒杆菌转化实验  30-32
    2.2.7 分析测定方法  32-34
    2.2.8 酶活分析  34-36
3 结果与讨论  36-59
  3.1 基因克隆  36-41
    3.1.1 Hafnia alvei AS1.1009染色体DNA的提取  36
    3.1.2 PCR扩增目的基因  36-37
    3.1.3 克隆载体的构建与鉴定  37
    3.1.4 酶切验证  37-39
    3.1.5 赖氨酸脱羧酶基因序列分析  39-41
  3.2 重组质粒pXMJ19-1dc的构建及鉴定  41-43
  3.3 重组质粒电转化C.glutamicum  43-45
    3.3.1 培养基对C.glutamicum电击转化的影响  43
    3.3.2 细菌生长至不同时期对转化效率的影响  43
    3.3.3 电场强度对转化率的影响  43-44
    3.3.4 细胞浓度对转化效率的影响  44-45
  3.4 重组菌株的获得与基因鉴定  45-46
  3.5 SDS-PAGE检测  46
  3.6 相关产物检测  46-50
    3.6.1 赖氨酸的定性分析  46-47
    3.6.2 赖氨酸的定量测定  47
    3.6.3 葡萄糖定量测定  47-48
    3.6.4 尸胺分析  48-50
  3.7 基因工程菌发酵条件的研究  50-55
    3.7.1 重组菌与原始菌生长曲线及重组菌的初始尸胺产量  50-51
    3.7.2 接种量对发酵的影响  51-52
    3.7.3 供氧条件对尸胺发酵的影响  52-53
    3.7.4 碳源、氮源、豆饼水解液对尸胺发酵的影响  53-55
    3.7.5 添加醋酸对发酵的影响  55
  3.8 优化条件下发酵  55-57
  3.9 酶活测定  57-59
4 结论  59-60
5 展望  60-61
6 参考文献  61-66

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制氨基酸 > 谷氨酸
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