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西尼罗病毒DNA形式复制子的构建及免疫原性研究

作　者: 曹飞
导　师: 秦鄂德; 秦成峰
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 西尼罗病毒复制子 DNA疫苗免疫原性
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

西尼罗病毒(West Nile virus)属于黄病毒科黄病毒属,该病毒感染人类可导致西尼罗热、西尼罗脑炎、脑膜炎等严重疾病。自1999年首次在美国纽约暴发流行后,西尼罗病毒在北美地区迅速蔓延,每年可导致3000多人患病,上百人死亡。尤其是最近几年,在全球变暖和国际交流日益频繁的大环境下,西尼罗病毒感染已经成为全球公共卫生的重要威胁。目前尚无安全有效的人用西尼罗病毒疫苗。DNA疫苗是一种新型的疫苗形式。基于复制子技术的DNA疫苗有望成为西尼罗病毒疫苗研究的重要工具。复制子(replicon)作为能自主复制的病毒亚基因组,是研究病毒复制机制及疫苗研发的理想工具。它具有病毒基因组的复制活性,但无法表达病毒结构蛋白,在细胞中不能产生有感染性的病毒颗粒,具有良好的安全性。复制子具有两种传递形式:DNA形式和RNA形式。近几年报道的西尼罗病毒复制子大都是RNA形式,这种基于SP6或T7启动子的复制子具有操作繁琐和不稳定的缺点。而DNA形式的复制子基于CMV早期启动子不需体外转录,可直接转染真核细胞,具有良好的应用前景。另外,黄病毒复制子的免疫原性目前尚不明确。为此,本研究首先在西尼罗病毒全长感染性克隆基础上,利用反向遗传学技术构建了一系列DNA形式的西尼罗病毒复制子,并通过表达报告基因对复制子活性进行了检测。然后将构建的DNA形式的西尼罗病毒复制子免疫小鼠,分别从体液免疫和细胞免疫方面对复制子的免疫原性进行了观察。从而为西尼罗病毒DNA疫苗的研发奠定基础。1.DNA形式的西尼罗病毒复制子的构建与鉴定为了构建DNA形式的西尼罗病毒复制子,选用具有CMV启动子的pWNIIrep-REN-IB质粒载体作为复制子载体,首先将西尼罗病毒cDNA的3’半分子(NS1-3’UTR)连入该载体,再通过融合PCR等方法对连入的西尼罗病毒半分子的上游和下游序列分别进行了改造。为了保证复制子具有复制活性,保留了病毒基因组的非编码区,编码C蛋白N端99个氨基酸和E蛋白C端26个氨基酸的结构蛋白基因及全部非结构基因。同时,在西尼罗病毒3’半分子的下游引入了丁型肝炎病毒的核酶(HDVr)及猴病毒40 (SV40)的多聚腺甘酸序列。最终获得了西尼罗病毒复制子pWNrep,经DNA酶切和测序证实无误。在此基础上,分别把eGFP和Rluc报告基因插入到复制子pWNrep结构基因缺失区,采用双顺反子策略获得了两个含有不同报告基因的西尼罗病毒复制子pWNrep/eGFP和pWNrep/Rluc。同时,构建了pWNrep/Rluc相应的复制缺陷对照pWNrep/Rluc△NS5。为进一步在细胞中评价上述复制子的复制能力,分别将构建的复制子转染BHK21细胞,结果在pWNrep/eGFP转染的细胞中可观察到特异的GFP表达,并能够持续至转染后60 h;而转染pWNrep/Rluc和pWNrep/Rluc△NS5复制子后,对细胞裂解物的荧光素酶活性进行检测,结果显示, pWNrep/Rluc转染后24h,Rluc活性达到第一个峰值,从36h到60h,Rluc活性持续升高。而缺失了病毒复制酶(NS5)基因的pWNrep/Rluc△NS5对照组的Rluc活性迅速降低。进一步通过RT-PCR检测表达Rluc细胞中的复制子RNA,结果表明,只有pWNrep/Rluc样品中能检测出西尼罗病毒3’UTR特异片段。这些结果说明,DNA形式的西尼罗病毒复制子能够表达外源基因,具有良好的复制活性,为下一步观察该复制子的免疫原性奠定了基础。2.DNA形式的西尼罗病毒复制子的免疫原性观察我们用复制子pWNrep质粒通过肌肉注射途径免疫4周龄的BAL B/c雌性小鼠,每2周免疫1次,共免疫3次。空载体pVec和PBS(100μl/只)作为对照。首先采用间接免疫荧光法检测小鼠血清中IgG抗体水平,结果表明,免疫三次后,pWNrep复制子DNA免疫组可检测到特异识别西尼罗病毒NS1蛋白的IgG抗体,血清效价达1:160,而对照组均未检测到相应抗体的存在。同时,采用蚀斑减少中和试验检测了小鼠血清中针对西尼罗病毒的中和抗体水平。结果显示,随着免疫次数的增加,复制子免疫组的血清中和效价呈现一个动态增长的过程,初次免疫后第1周,血清效价为1:19,而初次免疫后第5周,效价达到1:47。初次免疫后第13周中和效价达1:55,而对照组均未检测到中和抗体。结果表明:DNA形式的西尼罗病毒复制子能够激活小鼠的体液免疫反应,诱导产生西尼罗病毒特异的中和抗体。我们进一步通过脾细胞增殖和脾细胞IFN-γ实验分析了小鼠的细胞免疫水平。结果显示,经西尼罗病毒NS1抗原刺激后,复制子pWNrep DNA免疫组脾细胞增殖活性明显增加,刺激指数(SI)达到(8.9±0.7)约为空载体对照组的3倍,为PBS对照组的4倍,具有显著的统计学差异(p<0.01)。其分泌的IFN-γ水平为(99.0±18.8)pg/ml也显著高于对照组(p<0.05)。由此表明,DNA形式的西尼罗病毒复制子能在小鼠体内激活T细胞记忆性免疫应答和细胞因子释放通路,诱导高水平的T细胞免疫应答反应。总之,本研究成功构建了DNA形式的西尼罗病毒复制子,该复制子不仅具有良好的复制活性,而且在小鼠模型中能够诱导有效的细胞和体液免疫反应。该研究为西尼罗病毒DNA疫苗的研发提供了新的策略,也为其他蚊媒黄病毒复制子研究提供了新的方法。

全文目录

缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
Abstract  9-12
前言  12-15
第一部分西尼罗病毒 DNA 形式复制子的构建与鉴定  15-29
第二部分西尼罗病毒 DNA 形式复制子的免疫原性观察  29-39
总结  39-41
参考文献  41-47
硕士期间撰写的论著  47-48
综述:西尼罗热疫苗的研究进展  48-51
论文:西尼罗病毒 Chin-01 株复制子的构建及鉴定  51-61
个人简历  61-63
致谢  63

西尼罗病毒DNA形式复制子的构建及免疫原性研究

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