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犬细小病毒JL09-11株的分离鉴定及免疫研究

作　者: 孙相鑫
导　师: 扈荣良
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 犬细小病毒分离鉴定进化分析灭活和免疫
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

犬细小病毒病是一种感染犬和野生犬科动物的急性接触性传染病,对我国乃至世界的养犬业造成了较大的危害,因此,在初生幼犬的免疫程序中,犬细小病毒病的免疫是必不可少的。同时,犬细小病毒是一种变异性极强的病毒,自从1978年CPV-2被成功分离以来,人们已经发现了数种变异变种,包括CPV-2a,CPV-2b,和CPV-2c等。这些变种主要是由于犬细小病毒粒子表面主要抗原位点上的氨基酸序列发生变异造成的。这些位点上的氨基酸变异使得病毒具有了不同的抗原性,这种抗原性上的差异可以用单克隆抗体进行鉴别。虽然人们已经证实在大多数情况下,犬细小病毒的不同变种毒株之间具有完全的免疫保护力,但是由于疫苗株病毒与流行毒株抗原性的差异而造成免疫失败的案例也时有报道。因此,对本病进行防控的主要任务就是跟踪病毒的流行变异趋势,研制针对正在流行的病毒株的疫苗,以免由于新型病毒的出现或异种抗原类型毒株的侵入而有可能造成的大规模流行,对家犬或野生犬科动物造成较严重的危害。本研究取吉林省境内一只疑似患有犬细小病毒病的病犬肠内容物作为病料,对其进行PCR检测,结果为阳性。之后将病料研磨,过滤后接种F81细胞系进行犬细小病毒的分离。在接种4天后,细胞出现了犬细小病毒特异性的病变,同时正常细胞对照未产生类似的细胞病变。将病变的细胞上清冻融三次收毒后在F81细胞系上继续传代,连续传代三次后病变依然稳定。我们分别用PCR方法,血凝和血凝抑制试验对细胞培养物中的犬细小病毒进行检测,结果均为阳性。其中在应用PCR的方法进行检测的过程中,我们采用的是肉食类动物犬细小病毒的通用引物,结果出现了目的条带;血凝试验的结果显示细胞培养物中犬细小病毒的血凝效价为212为了对所分离的犬细小病毒毒株进行进化分析和氨基酸序列分析,我们首先用有限稀释法对病毒进行了纯化,将纯化后的病毒作为模板,对其主要抗原基因VP2进行扩增,并测序。结果发现我们分离到的犬细小病毒是一株具有新型抗原特性的犬细小病毒,这表现在其VP2基因的主要抗原位点上的氨基酸序列较以前分离得到的任何一个变种都不完全一致。我们收集在NCBI数据库中存在的国内犬细小病毒分离株的VP2基因序列,与JL09-11株一并进行了进化分析,结果发现JL09-11株在进化树中与国内的CPV-2a变种具有较近的进化关系。但是在对本株CPV进行氨基酸序列分析的过程中,我们发现它并不能被归为CPV-2a这一变种,;血凝抑制试验的结果表明,细胞培养物的血凝作用可以被本实验室保存的抗犬细小病毒的阳性血清所抑制。至此我们确定已经分离得到犬细小病毒,并将其命名为JL09-11株。原因是其297位氨基酸与CPV-2b变种相同,是A而不是S,对国内分离到的各个CPV毒株进行进一步的分析发现,国内所分离到的大多数被定义为CPV-2a变种的毒株其297位氨基酸是A而非S。同S297A变种比较又有555位氨基酸的差异,我们认为我国流行的大多数CPV毒株具有这样的特点,它们是介于CPV-2和CPV-2c之间的进化变种。因此以具有本国CPV抗原特性的CPV毒株为毒种,研制灭活疫苗,对我国犬细小病毒病的流行具有很好的针对性。我们将JL09-11株犬细小病毒灭活后辅以本实验室配制的纳米佐剂对其免疫效果进行了评价,为JL09-11株毒种灭活疫苗的研制奠定基础。在进行JL09-11株犬细小病毒进行免疫效果评价之前,我们首先在F81细胞系上建立了中和试验,用以测定血清中犬细小病毒的中和抗体。为以后灭活疫苗的免疫效果评价做准备。将JL09-11株犬细小病毒的细胞培养悬液于37℃使用1%的甲醛灭活24小时后,对其进行TCID50我们采用未接种任何疫苗,且外周血中犬细小病毒中和抗体滴度较低的健康家犬来对我们灭活犬细小病毒JL09-11株的免疫效果进行评价。在免疫试验过程中,每条试验犬注射灭活疫苗的剂量为1.5ml,其中含有大约5.0×10的测定,结果显示病毒已经完全被灭活。然后以4:1的比例与本实验室制备的纳米佐剂进行混合后制成犬细小病毒的灭活疫苗。5个TCID50通过本研究我们分离到了一株新的犬细小病毒,进化分析显示,本株犬细小病毒与国内的CPV-2a变种具有较近的进化关系。并且我们发现,国内的大多数被归为CPV-2a变种的毒株与JL09-11一样,主要抗原蛋白VP2的第297位氨基酸均为A,同时其555位氨基酸发生了由I到V的回复突变。这与CPV-2b和CPV-2c相同。我们发现国内流行的主要就是带有这两个突变的CPV-2a变种。我们利用本研究所分离到的JL09-11株犬细小病毒进行了灭活和免疫试验,结果证明,我们分离到的JL09-11株犬细小病毒具有较好的免疫原性,具有用于研制灭活疫苗的应用潜力。经过灭活的犬细小病毒。在免疫前以及免疫后14天,分别对试验犬外周血中的犬细小病毒中和抗体滴度进行测定。结果显示,在免疫后14天试验犬外周血中的犬细小病毒中和抗体较免疫前得到了显著提高。证明了本研究所分离得到的犬细小病毒具有研制灭活疫苗的潜力。

全文目录

英文缩略词表  6-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
前言  12-14
第一篇实验内容  14-38
  第1章犬细小病毒JL09-11 株的分离鉴定及细胞培养  14-24
    1 材料和方法  14-20
    2 结果  20-22
    3 讨论  22-23
    4 小结  23-24
  第2章 JL09-11 株犬细小病毒的克隆和VP2 基因的进化分析  24-30
    1 材料与方法  24-25
    2 结果  25-28
    3 讨论  28-29
    4 小结  29-30
  第3章 JL09-11 株犬细小病毒的灭活与免疫试验  30-36
    1 材料与方法  30-31
    2 结果  31-33
    3 讨论  33-34
    4 小结  34-36
  结论  36-38
第二篇文献综述  38-58
  第1章犬细小病毒及犬细小病毒病  38-42
    1 犬细小病毒的特性  38-39
    2 犬细小病毒病  39-40
    3 犬细小病毒病的发病机理  40-42
  第2章犬细小病毒的分子生物学特性及其进化变异  42-50
    1 犬细小病毒的分子生物学特征  42-43
    2 犬细小病毒的进化和变异  43-45
    3 犬细小病毒衣壳蛋白上氨基酸的变化与其流行和进化的关系  45-48
    4 犬细小病毒的流行病学  48-50
  第3章犬细小病毒病的诊断方法  50-54
    1 血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）  50
    2 病毒的分离  50-51
    3 PCR 方法  51
    4 电镜和免疫电镜技术  51
    5 ELISA 法  51-52
    6 单克隆抗体技术  52-54
  第4章犬细小病毒病自身免疫和疫苗的研究现状  54-58
    1 犬细小病毒病的自身免疫  54
    2 犬细小病毒疫苗的研究进展  54-58
参考文献  58-63
致谢  63-64
作者简介  64

犬细小病毒JL09-11株的分离鉴定及免疫研究

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