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两株狂犬病病毒糖蛋白的杆状病毒表达及其免疫原性研究

作　者: 陈奇
导　师: 扈荣良
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 狂犬病病毒糖蛋白杆状病毒免疫原性
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

狂犬病是指由狂犬病病毒（rabies virus,RV）感染动物机体而引起的一种以脑脊髓炎为主要病理特征，以神经症状为主要临床表现的人兽共患传染病。古埃及时代该传染病就已经开始流行，直到2012年，全球范围内仍有90多个国家或地区发生狂犬病。近十年来，全球每年约有50,000至60,000人死于该病。在我国，每年患狂犬病死亡人数多达2000～3000人。虽然近些年来偶有关于人狂犬病治愈的报道，但现在仍然没有有效的治疗规程和相关药物，所以一旦狂犬病病毒感染后出现神经症状，死亡率仍几乎为100%。因此，目前防控狂犬病的策略仍然是以预防为主，接种疫苗是其中最为有效的方法。这不仅是因为人暴露狂犬病后及时接种狂犬疫苗能使自身产生抗体，从而有效预防狂犬病的发生，更重要的是如果在狂犬病的中间宿主群体中进行了高覆盖率（70%）的免疫接种，则可切断狂犬病病毒在中间宿主群体间的传播，从而为彻底消灭狂犬病提供可能。现在，市面上的人或动物狂犬疫苗大都为灭活疫苗。但灭活苗成本较高，对于经济欠发达国家来说不是有效控制、消灭狂犬病的理想选择。亚单位疫苗属于基因工程疫苗的一种，价格一般相对低廉，且不像重组活载体疫苗那样涉及活载体病毒等生物安全因素，相对安全，易得到相关部门审批，现已有多种亚单位疫苗得到临床应用。因此，亚单位疫苗有望作为新型狂犬疫苗的重点发展方向之一。本研究以探索狂犬病亚单位疫苗研制为目的，开展了如下试验：1.狂犬病病毒糖蛋白基因重组杆状病毒的构建。试验内容：①狂犬病病毒街毒株BD06及疫苗株SRV9糖蛋白基因的RT-PCR扩增获取。②将两种糖蛋白基因分别克隆入Bac-to-Bac杆状病毒表达系统所提供的供体质粒（pFastBacI）中，酶切鉴定正确后，转化DH10Bac^TM感受态细胞，待重组供体质粒与其中穿梭质粒（含有杆状病毒全基因组的质粒，Bacmid）发生定向转座后，挑取白色单菌落，提取重组穿梭质粒后，以M13通用引物对重组穿梭质粒进行PCR鉴定，之后选取构建正确克隆。③以鉴定正确的重组穿梭质粒转染Sf9细胞，拯救重组杆状病毒，并通过电镜观察等方法对其进行形态学鉴定。④以免疫荧光、SDS-PAGE及western blot等方法鉴定重组杆状病毒是否成功表达狂犬病病毒糖蛋白。2.重组杆状病毒表达的狂犬病病毒糖蛋白的免疫原性试验。试验内容：①两种粗制狂犬病病毒糖蛋白以高、低两个梯度的剂量分别免疫小鼠。②免疫后14d及28d分别对免疫小鼠进行尾静脉采血并分离血清，以荧光抗体病毒中和试验（FAVN）方法测定血清中狂犬病病毒中和抗体水平。③免疫后35d，以100LD₅₀狂犬标准攻击毒（CVS-24）对所有免疫组小鼠进行脑内攻毒试验。④攻毒后每日观察，记录小鼠死亡状况，统计试验结果，分析两种糖蛋白免疫效果，评价其免疫原性并比较两种糖蛋白的免疫原性是否具有差异。通过上述试验，获得以下试验结果：1.成功扩增出SRV9株与BD06株狂犬病病毒糖蛋白基因，将其克隆至供体质粒后，经酶切鉴定，获得正确构建的重组供体质粒。PCR鉴定结果显示成功获得分别含有SRV9株与BD06株狂犬病病毒糖蛋白基因的重组穿梭质粒。电镜观察转染后出现细胞病变的细胞培养物，可观察到具有明显杆状病毒形态的病毒颗粒。对接种第三代重组杆状病毒病变的Sf9细胞进行SDS-PAGE及wesern blot鉴定，结果显示在接近72kDa大小处出现蛋白条带，野生型杆状病毒感染细胞在相应位置未出现类似蛋白条带。对接种第三代重组杆状病毒的Sf9细胞以狂犬病病毒糖蛋白荧光单抗进行荧光抗体染色，荧光显微镜下可观察到特异性绿色荧光，野生型杆状病毒感染昆虫细胞经同样处理后荧光显微镜下没有观察到特异性绿色荧光。2.重组杆状病毒表达的狂犬病病毒糖蛋白小鼠免疫结果显示，SRV9株糖蛋白与BD06株糖蛋白在高剂量水平时，均可诱导100%的小鼠发生血清阳转，整体抗体水平分别能达到13.5IU/ml和3.42IU/ml，并能提供100%的针对致死剂量狂犬病病毒的攻毒保护；但在低剂量水平时，SRV9株糖蛋白仅能够诱导部分小鼠发生阳转，整体抗体水平接近于0，且不能为小鼠提供任何保护，而BD06株糖蛋白依然可以诱导100%小鼠发生阳转（整体抗体水平依然可以达到5.92IU/ml）并能为其提供80%的保护率。经统计学分析，在两种狂犬病病毒糖蛋白在诱导小鼠产生抗体水平及发生阳转率方面差异均极为显著（p＜0.01）。通过以上结果，得出以下结论：1.获得两株能够分别表达狂犬病病毒SRV9株与BD06株糖蛋白的重组杆状病毒。重组杆状病毒所表达出的两种糖蛋白均具有免疫原性，能够作为狂犬病亚单位疫苗研制的候选抗原。2.BD06株糖蛋白的免疫原性要显著高于SRV9株糖蛋白，这表明前者更适合用于亚单位疫苗的研制。3.不同毒株糖蛋白免疫原性存在显著性差异表明进一步筛选免疫原性更高的糖蛋白具有重要意义，且筛选范围不必局限于狂犬病病毒疫苗株。论文创新点：1.通过研究杆状病毒表达系统所表达出的狂犬病病毒疫苗株和街毒株糖蛋白的免疫原性，探索了以此为基础研制亚单位疫苗的可能性。2.对街毒株与疫苗株糖蛋白免疫原性进行了对比，发现有可能存在街毒株糖蛋白免疫原性高于疫苗株糖蛋白的现象，该发现为以后在狂犬病基因工程疫苗构建时糖蛋白基因的选择提供了一定的启发和参考。

两株狂犬病病毒糖蛋白的杆状病毒表达及其免疫原性研究

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