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丙型肝炎病毒血清学分型方法的建立及初步临床评价

作　者: 杨锡琴
导　师: 彭瑞云; 张贺秋
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 丙型肝炎病毒竞争抑制酶联免疫技术基因分型血清分型
分类号: R373.21
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

据世界卫生组织统计，目前全球约有1.8亿人（占全球人口的3%）感染HCV，其中1.3亿人为慢性HCV携带者。根据1992～1995年第二次病毒性肝炎血清学流行病调查结果显示，我国人群抗-HCV的阳性率平均为3.2%，属于中度流行。丙型肝炎易发展成慢性，约75%～85%急性肝炎可发展成慢性肝炎甚至肝硬化和肝癌。感染丙型肝炎病毒的病人在20～30年内肝硬化发生率为10～25%，HCV引发的肝硬化病人10年后肝功能失代偿发生率为30%，肝癌年发生率为1%～3%，给我国的公共卫生事业带来极大的危害。HCV为单股正链RNA病毒，属黄病毒科，于1989年首次克隆成功，基因组全长约9.5kb，含有一个约9033个核苷酸构成的开放读码框，编码结构蛋白和非结构蛋白。结构蛋白包括核心蛋白(C)，包膜蛋白gp33(E1)、gp70(E2)，非结构蛋白有p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B等。由于RNA酶缺少校对功能，整个基因组呈现高度的变异性，目前HCV至少分为6个基因型和80多种以上的亚型。在我国，主要的基因型为1b，其次为2a，还有其它少见型别。根据我国《丙型肝炎防治指南》，慢性丙型肝炎标准治疗方案是以聚乙二醇化干扰素α和利巴韦林为主的联合治疗。其中，基因型是联合治疗方案的一个重要基线预测指标，对临床用药的剂量和时间具有重要指导意义。目前常用的基因分型主要方法包括特异性引物扩增后直接测序分析、限制性片段长度酶切多肽性（RFLP）分析、特异性探针PCR法及基因芯片法等，尽管方法的特异性和灵敏度很高，但由于基因分型方法需要HCV RNA提取等过程，操作复杂，技术要求高，一般实验室难以开展，而且当HCV-RNA阴性或由于保存不当及处理过程中HCV-RNA遭到破坏时，则不能进行基因分型。为此，学者提出了HCV血清学分型，即在HCV基因型特异性抗原表位筛选的基础上，采用血清学技术，根据患者体内型特异性抗体的存在情况，进行血清学分型。目前国际上商品化的HCV血清分型试剂主要有3种，分别是Murex HCV1-6型、Chiron RIBA1-3型和日本HCV1、2血清分型试剂盒。其中美国Abbott公司的Murex HCV1-6型血清分型试剂是根据HCV-NS4区基因片段合成1-6型的型特异性多肽，采用抗原竞争免疫酶联法，鉴定与基因型相对应的不同血清型。由于受到不同国家地区及标本选择的影响，该试剂临床评价结果不尽相同，分型率大致为60%～80%，与基因分型的符合率为90%～97%；Chiron公司研制生产的RIBAHCV血清分型试纸条采用免疫胶体金技术，根据NS4区型特异性表位多肽为主，Core区型特异性表位多肽为辅进行血清学分型，其分型率能达到80%以上，特异性在90%～96%；另外日本国际试药株式会社的HCV Gr分型试剂盒是根据NS4区型特异性的抗原肽建立的血清分型试剂，仅能鉴定1、2型，分型率为89.6%，特异性为96.0%。但这些商品化的血清分型试剂在我国尚未注册，且价格昂贵，难于获得，因此，本课题旨在研究建立针对我国主要流行基因型对应血清型的分型方法，填补国内空白。本课题根据文献报道，从HCV databases数据库（http://hcv.lanl.gov/content/index）下载丙型肝炎病毒NS4区的氨基酸序列，通过Biosun生物信息学软件对HCV-NS4区序列的抗原表位进行预测分析，确定HCV-NS4区抗原表位主要位于1693～1708aa，C区型别特异性抗原表位位于67～81aa，并通过HCVdatabases数据库在线进行同源性比对分析，最后确定NS4区Ⅰ型氨基酸序列为AⅡPDREVLYQEFDEM，Ⅱ型氨基酸序列为VVAPDKEVLYEAFDEM，C区I型氨基酸序列为KARRPEGRTWAQPGY， Ⅱ型氨基酸序列为KDRRTTGKSWGRPGY。根据确定的型别特异性氨基酸序列，采用大肠杆菌优势密码子推断出其对应的核苷酸序列，通过重叠延伸PCR技术合成C-Ⅰ、C-Ⅱ、NS4-Ⅰ、NS4-Ⅱ、C+NS4-Ⅰ型嵌合及C+NS4-Ⅱ型嵌合基因，酶切后插入PGEX-4T-2载体中，构建出6株高效表达质粒，并采用GST琼脂糖凝胶FF柱进行纯化，获得了6个纯度均为95%以上的抗原。通过间接ELISA方法，采用50例抗-HCV抗体阳性的基因分型血清对6个抗原的抗原活性进行初步检测，结果显示：获得的3个Ⅰ型抗原C-Ⅰ、NS4-Ⅰ及C+NS4-Ⅰ嵌合与HCV-1b型血清的反应性分别为25.71%、74.28%、88.57%，与HCV-2a型血清之间的交叉反应性分别为20.00%、40.00%、66.67%，Ⅰ型抗原与1b血清之间的反应性均高于与2a血清的反应性，表现出Ⅰ型抗原特有的型别特异性；获得的3个Ⅱ型抗原C-Ⅱ、NS4-Ⅱ、及C+NS4-Ⅱ嵌合与2a型血清的反应性分别为33.33%、66.67%、73.33%，与1b型血清的交叉反应性分别为11.42%、48.57%、28.57%，获得的Ⅱ型抗原与2a型血清的反应性显著高于1b型，表现出Ⅱ型抗原特有的型别特异性。为了消除型别特异性抗原与I、Ⅱ型血清之间交叉反应性，本研究采用竞争免疫酶联法，并通过20组不同的实验进行HCV血清分型检测方法的系统优化，最终确定HCV血清分型检测方法的工艺条件为：PH9.6碳酸盐缓冲液作为包被液；20%山羊血清-0.01M PBS PH7.4为封闭液；LD5-HRP作为酶结合物（LD5是一种新的、具有更广泛IgG结合特性的分子）；确定竞争抗原的浓度为1.5μg/μl；竞争抗原稀释液为山羊血清(5%)、酪蛋白(0.5%)-0.01M PBS PH7.4；4个NS4-I、C-Ⅰ、NS4-Ⅱ及C-Ⅱ型分片段抗原作为包被抗原，2个I、Ⅱ型嵌合抗原作为竞争抗原，设计了HCV血清分型的4孔检测模式，并确定了结果判读的计算方法。采用128例HCV-1b血清和72例HCV-2a型血清对该技术进行初步的临床评价，检出Ⅰ型102例，Ⅱ型58例，I、Ⅱ混合型2例，整体分型率为81.00%，与基因分型方法之间具有很好的一致性，其符合率分别为97.05%（kappa=0.959，p=0.024），接近国际报道。进一步研究显示：本血清分型方法与117例非HCV感染的肝炎及其他肝病患者血清之间没有明显的交叉性，且分型效率与患者的年龄、抗体S/Co、HCV RNA滴度无关。本研究的创新之处在于采用包含C区、NS4区两个区段的型别特异性抗原进行HCV血清分型，克服了抗体谱单一的问题，提高了样本分型率；除此以外，本研究引入竞争免疫酶联技术进行HCV血清分型及工艺优化的研究，相比间接酶联免疫技术，极大的提高了HCV血清分型的准确率。本研究建立的以竞争免疫酶联技术为基础的HCV血清型分型方法，与基因分型技术间具有很好的一致性，且操作简单、快速、不易污染，也不需要特殊仪器设备和专业人员，特别适合我国基层医疗机构推广使用，有很好的临床应用前景。

全文目录

目录  3-6
缩略词表  6-7
摘要  7-10
Abstract  10-13
前言  13-16
第一章丙型肝炎病毒型别特异性抗原的克隆表达及纯化  16-39
  1 材料和方法  16-24
    1.1 实验材料  16-19
      1.1.1 菌株及质粒  16
      1.1.2 工具酶与试剂盒  16
      1.1.3 试剂  16
      1.1.4 主要仪器设备  16-17
      1.1.5 主要配制试剂  17-19
    1.2 实验方法  19-24
      1.2.1 抗原表位分析  19
      1.2.2 原核表达载体的构建  19-22
        1.2.2.1 退火延伸PCR法合成HCV血清I、Ⅱ型抗原基因  19-20
        1.2.2.2 PCR产物的回收  20
        1.2.2.3 PGEX-4T-2 质粒抽取  20-21
        1.2.2.4 酶切  21
        1.2.2.5 连接  21
        1.2.2.6 连接产物的转化及阳性克隆的鉴定  21-22
        1.2.2.7 产物序列测定  22
      1.2.3 工程菌的诱导  22-23
      1.2.4 蛋白的纯化  23
      1.2.5 抗原纯度测定  23
      1.2.6 抗原活性鉴定  23-24
      1.2.7 抗原交叉反应性鉴定  24
      1.2.8 统计分析  24
  2 实验结果  24-36
    2.1 HCV 型别特异性抗原表位的确定  24-27
    2.2 HCV血清I、Ⅱ型基因片段的获得  27-28
    2.3 表达载体的构建及鉴定  28-30
    2.4 目的蛋白的纯化及纯度分子量鉴定  30-32
    2.5 抗原活性鉴定  32-34
    2.7 抗原交叉反应性鉴定  34-36
  3 讨论  36-39
第二章丙型肝炎病毒血清学分型方法的建立及优化  39-55
  1 材料与方法  39-44
    1.1 材料  39-40
      1.1.1 仪器设备  39
      1.1.2 试剂配制  39-40
    1.2 实验方法  40-44
      1.2.1 封闭液的确定  40-41
      1.2.2 酶结合物的确定  41
      1.2.3 竞争抗原浓度的确定  41
      1.2.4 竞争抗原稀释液的确定  41-42
      1.2.5 不中和孔cut-off值的确定  42
      1.2.6 抗原的组合配对  42-44
  2 实验结果  44-52
    2.1 封闭液的确定  44
    2.2 酶结合物的确定  44-45
    2.3 竞争抗原浓度的确定  45-46
    2.4 竞争抗原稀释液的确定  46
    2.5 不中和孔cut-off值的确定  46-47
    2.6 抗原的组合配对  47-52
  3 讨论  52-55
第三章丙型肝炎病毒血清学分型方法的初步临床评价  55-66
  1 材料与方法  55-58
    1.1 材料  55-56
      1.1.1 标本来源  55
      1.1.2 仪器设备  55
      1.1.3 试剂配制  55-56
    1.2 实验方法  56-58
      1.2.1 血清处理  56
      1.2.2 HCV RNA 检测  56
      1.2.3 HCV基因分型  56
      1.2.4 抗HCV 检测  56-57
      1.2.5 HCV 血清分型检测  57-58
      1.2.6 统计分析  58
      1.2.7 与其他肝病患者血清的交叉反应  58
  2 实验结果  58-64
    2.1 抗HCV抗体及HCV RNA 检测  58
    2.2 HCV 基因分型  58
    2.3 HCV 血清分型  58-63
    2.4 HCV血清型与基因型的符合率  63
    2.5 年龄、抗体S/Co 、HCV RNA与分型间的关系  63-64
    2.6 与其他肝病患者血清的交叉反应  64
  3 讨论  64-66
结论  66-68
参考文献  68-71
致谢  71-72
个人简历  72-74
文献综述  74-83
  参考文献  78-83
附发表论文  83-93

丙型肝炎病毒血清学分型方法的建立及初步临床评价

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