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10株新城疫病毒（弱毒）的遗传进化分析

作　者: 金仕强
导　师: 左之才; 丁铲
学　校: 四川农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 新城疫病毒 F基因 Class Ⅰ 生物学特性 遗传进化分析
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)强毒株引起禽类的一种急性、热性、高度接触性传染病。本病曾多次在世界范围内大流行,给养禽业带来了巨大的经济损失。但近年有研究表明,某些NDV弱毒株(如：Class Ⅰ毒株Goose/Alaska/415/91)的毒力可以在自然环境和实验室条件下返强,并对鸡群造成100%的发病和死亡。具有毒力返强的NDV弱毒株将成为养禽业潜在的威胁。新城疫弱毒株主要包括Class Ⅰ中的基因1-9型及Class Ⅱ中的全部基因Ⅰ型和部分基因Ⅱ型。迄今为止,关于Class Ⅱ NDV弱毒株的研究已较为广泛而深入；关于Class Ⅰ NDV的研究主要局限于流行病学和鉴定方法上,有关其各基因片段的遗传进化及毒力演变机制等方面的研究相对匮乏。因此,加强NDV弱毒株特别是Class Ⅰ新城疫病毒的遗传特性以及毒力演变机制等方面的研究有利于消除新城疫流行的潜在威胁,具有重要现实意义。1.10株NDV(弱毒)部分F基因的遗传进化分析采用RT-PCR技术扩增来自表征健康禽群的10株NDV的F基因,通过测序获得F基因主要功能区的序列,并应用DNA Star及Lasergene软件对其分析。结果显示：10株NDV的F蛋白裂解位点处的氨基酸序列为112G/E-K/Q-Q-G/E-R-L117,均符合弱毒株NDV特征,表明这10株NDV均属弱毒株。F基因的遗传进化分析显示,10株NDV中的JS/7/09/Du、ZJ/6/09/Du、AH/11/08/Du、JS/2/09/Du、ZJ/11/10/Du、JS/8/10/Go共6株,为Class Ⅱ中的基因Ⅰ型,与参考毒株D/JS/7/05、A/FarEast/3658等处于同一个分支上：JS/9/08/Go、AH/2/10/Du、JS/3/09/Ch、ZJ/3/10/Ch共4株,为Class Ⅰ中的基因3型,与参考毒株的NDV08-004、Df/HK/1875等处于同一分支上。可见,从健康禽群分离的10株NDV中,有4株属于Class Ⅰ中的基因3型,6株属于Class Ⅱ中的基因Ⅰ型,均属于弱毒株。2.4株Class Ⅰ NDV的生物学特性研究选取从健康禽群分离的4株Class Ⅰ NDV(鸡源2株、鸭源1株、鹅源1株)进一步研究来自不同宿主的Class Ⅰ NDV的生物学特性有无差异。采用鸡胚有限稀释法对4株Class Ⅰ NDV毒株进行纯化,测定其纯化前、后的血凝特性及纯化后毒株的血凝解脱、血凝素对热的稳定性、最小致死量鸡胚平均死亡时间、1日龄雏鸡脑内接种致病指数等指标。结果：4株Class I NDV纯化前、后的HA值无明显差异。4株病毒的血凝解脱为慢速解脱型,其血凝素对热稳定；MDT值大于120h,ICPI值小于0.2。结果表明：4株Class I NDV的生物学特性相似,无明显差异；根据MDT值和ICPI值将这4株Class I NDV判定为弱毒株,这与F基因测序判定结果一致。3.4株Class I NDV的分子特征分析为进一步探明4株Class I NDV的分子特征,设计了12对引物对其各基因组片段进行扩增,通过测序获得4株Class I NDV除3′和5′最末端引物设计区域以外的整个基因组的核苷酸序列,并应用DNA Star及Lasergene软件进行分析。核苷酸序列分析结果显示,4株Class I NDV与己知7株Class I NDV的分子特征一致。分离的4株Class I NDV与7株参考Class I NDV的各基因片段同源性比较,结果显示：各Class I NDV毒株间HN基因的同源性较低,L基因的同源性较高。与在实验室条件下毒力可以返强毒株Goose/Alaska/415/91各基因片段的同源性比较,结果显示,分离株ZJ/3/10/Ch与Goose/Alaska/415/91的同源性高于其他3株,其F基因和HN基因的同源性分别达94.7%和94.8%,可见ZJ/3/10/Ch是4株分离Class Ⅰ NDV中毒力最有可能返强的毒株。比较4株分离Class Ⅰ NDV与7株参考Class Ⅰ NDV的各基因片段推导出的氨基酸同源性,结果显示：P蛋白同源性较低,L蛋白同源性较高。4株分离Class Ⅰ NDV与已知7株Class Ⅰ NDV各基因片段的遗传进化分析结果显示,分离株ZJ/3/10/Ch与参考株Goose/Alaska/415/91等的亲缘性相对较近,分离株JS/3/09/Ch、JS/9/08/Go和AH/2/10/Du与参考株NDV08-004的亲缘性相对较近；分离株ZJ/3/10/Ch与其他3株分离株的亲缘性相对较远,分离株JS/3/09/Ch、JS/9/08/Go和AH/2/10/Du间的亲缘性相对较近。可见弱毒Class I NDV可以在多种宿主内存在,来自鸡、鸭、鹅3个宿主的4株Class I NDV亲缘关系较近。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-7
符号说明  7-9
目录  9-12
文献综述 CLASS Ⅰ新城疫病毒的研究进展  12-28
  1 新城疫及新城疫病毒概述  12-14
  2 Class Ⅰ新城疫病毒的研究进展  14-23
    2.1 Class Ⅰ NDV的发现  14
    2.2 Class Ⅰ NDV的致病性  14-15
    2.3 Class Ⅰ NDV的基因组及结构蛋白特性  15-18
    2.4 Class Ⅰ NDV的基因分型及分子流行病学  18-19
    2.5 Class Ⅰ NDV的检测  19-21
    2.6 毒力演变  21
    2.7 展望  21-23
  参考文献  23-28
第一章 10株NDV(弱毒株)部分F基因的遗传进化分析  28-43
  1 材料  28-29
    1.1 毒株、血清和鸡胚  28-29
    1.2 主要分子生物学试剂  29
    1.3 主要仪器设备  29
  2 方法  29-34
    2.1 病毒的增值和鉴定  29-31
    2.2 F基因克隆与遗传进化分析  31-34
  3 结果  34-39
    3.1 病毒的增值及初步鉴定  34
    3.2 半套式RT-PCR扩增结果  34-35
    3.3 F基因部分片段的测定结果  35-36
    3.4 F基因遗传发育树  36-37
    3.5 10株分离株F基因部分序列及其推导出氨基酸的同源性比较  37-39
  4 讨论  39-41
    4.1 RT-PCR鉴定  39
    4.2 F基因片段遗传进化分析  39-41
  参考文献  41-43
第二章 4株CLASS Ⅰ NDV的生物学特性研究  43-52
  1 材料  43-44
    1.1 毒株、鸡胚及1日龄雏鸡  43
    1.2 主要试剂  43-44
  2 方法  44-45
    2.1 病毒的纯化及增值  44
    2.2 凝解脱实验  44
    2.3 凝素的热稳定实验  44
    2.4 鸡胚最小致死量平均时间(MDT)的测定  44-45
    2.5 1 日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)的测定  45
  3 结果  45-48
    3.1 4株Class Ⅰ NDV的鸡胚纯化结果  45
    3.2 凝解脱结果  45-46
    3.3 凝素热稳定结果  46-47
    3.4 MDT的测定结果  47
    3.5 ICPI测定结果  47-48
  4 讨论  48-50
    4.1 NDV病毒的纯化  48-49
    4.2 生物学特性与毒力  49-50
  参考文献  50-52
第三章 4株CLASS Ⅰ NDV的分子特征分析  52-76
  1 材料  53
    1.1 毒株  53
    1.2 主要试剂  53
  2 方法  53-55
    2.1 引物合成  53-54
    2.2 RNA的提取、反转录  54
    2.3 PCR扩增目的序列  54
    2.4 电泳、胶回收、连接、转化、克隆、质粒的提取及鉴定  54
    2.5 测序及基因组的拼接  54-55
    2.6 基因组的比对及分析  55
  3 结果  55-69
    3.1 基因组序列拼接和分析  55-56
    3.2 基因组序列同源性比较  56
    3.3 各基因片段及其推导出的氨基酸序列同源性比较  56-57
    3.4 各基因片段及其推导出的氨基酸序列同源性比较  57-62
    3.5 各基因分析  62-69
      3.5.1 NP基因分析  62-63
      3.5.2 P基因分析  63-64
      3.5.3 M基因分析  64-65
      3.5.4 F基因分析  65-67
      3.5.5 HN基因分析  67-68
      3.5.6 L基因分析  68-69
  4 讨论  69-73
    4.1 Class Ⅰ NDV的基因组  69-70
    4.2 Class Ⅰ NDV的各蛋白  70-71
    4.3 毒力演变  71-72
    4.4 新城疫病毒的遗传进化分析  72-73
  参考文献  73-76
结论  76-77
致谢  77-78
作者简介  78
硕士研究生期间公开发表的论文及参编书籍  78

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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