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粟酒裂殖酵母编码tRNA3\'末端加工酶基因trz1回复突变基因研究

作　者: 郑佳
导　师: 黄鹰
学　校: 南京师范大学
专　业: 生物技术
关键词: S.pombe tRNase Z 温敏菌株高表达致死抑制基因
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

tRNase Z是一种能够催化tRNA前体形成成熟的3’末端的tRNA的核酸内切酶,通过去除tRNA前体3’末端非编码CCA3’端多余序列来完成。tRNase Z属于金属-β-内酰胺酶超家族,第一个tRNase Z的基因在2002年被克隆,随后,tRNaseZ家族也不断的被人们所认识。人类tRNase Z基因ELAC2的突变会提高患前列腺癌的风险。本实验尝试运用裂殖酵母模式生物对人前列腺癌易感基因ELAC2的进化和功能方面进行研究。粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyce spombe中含有两种tRNase Z基因：Sptrz1+(SPAC1D4.10)和Sptrz2+(SPBC3D6.03c),它们编码的蛋白分别定位于细胞核和线粒体中。本课题组已经证实两种tRNase Z都是必需基因。本实验主要是对与Sptrz1+和Sptrz2+有相互作用的基因进行筛选和确定。在真核生物中,对粟酒裂殖酵母进行遗传操作的简便性仅次于芽殖酵母,这使得其成为进行细胞周期调控、有丝分裂和无丝分裂、DNA修复和重组研究的模式生物。本实验室已经构建了在37℃表现致死表型的Sptrz1+的温度敏感型菌株yZZTS1(N408K,Y571L,D702G)和Sptrz2+的温度敏感型菌株YGW1(A623V)来进行基因相互作用研究,希望通过这些研究对相关的人类癌症的了解提供一定的帮助。Sptrz1+的温度敏感型菌株yZZTS1可以被人ELAC2和芽殖酵母ScTrz1互补抑制37℃致死表型,表现了它们的功能保守型。进一步的实验发现,在37℃情况下,本该致死的trzl的温度敏感型突变菌株发生自发回复突变,有极少量能回复到野生型的表型,经实验确定,回复突变率大约为9.4×10-5。裂殖酵母trz1温度敏感突变菌株yZZTS1的回复突变菌株,可以抑制温敏型菌株37℃致死表型,为了探究是何种原因引起了这一回复表型,我们对该菌株的trz1基因及其上游启动子序列进行了鉴定,证明没有发生突变后,我们对回复突变菌株进行了全基因组测序,全基因组测序覆盖率为100%,覆盖深度65.9。我们将trz1温度敏感菌株的回复突变菌株全基因组测序结果,与NCBI Spombe972h-基因组对比之后,得到20个有义点突变,共18个基因发生突变,我们对其中6个感兴趣的基因做了鉴定和救活实验但是最终没有救活温度敏感菌株。本实验发现sptrz2+在高表达的情况下,会令野生型酵母细胞有致死毒性。为了探究体内是否存在功能上与SpTrz2p有互补作用的蛋白,我们尝试从粟酒裂殖酵母的cDNA文库SPLE-1(含有cDNA基因adh酒精启动子和actin终止子,含有6×105克隆,67%装载了lkb或者更多的插入序列)中筛选Sptrz2+高表达致死表型的高拷贝抑制基因的遗传学研究方法,从而筛选得到与Sptrz2+相互作用的基因。本实验共得到8个可以救活Sptrz2+高表达致死菌株的文库质粒。但是经测序发现其中7个质粒同时含有pREP4x和SPLE-1质粒部分,经测序发现,这2个质粒发生了融合,并且Sptrz2+被替换成nmt1基因。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
第1章综述  9-16
  1.1 tRNA前体3’末端的加工  10-12
  1.2 tRNASE Z的结构与功能研究  12-14
    1.2.1 tRNase Z的两种类型  12-13
    1.2.2 tRNase Z结构和功能  13-14
  1.3 TRNASE Z与疾病的关系  14
  1.4 粟酒裂殖酵母是研究基因相互作用的理想模式生物  14
  1.5 裂殖酵母温度敏感型菌株及回复突变  14-15
  1.6 粟酒裂殖酵母全基因组测序方法  15-16
第二章裂殖酵母trz1温度敏感菌株回复突变基因研究  16-41
  2.1 材料与方法  16-29
    2.1.1 材料  16
    2.1.2 培养基  16-18
    2.1.3 实验方法  18-29
  2.2 实验结果  29-39
    2.2.1 回复突变菌株trz1基因及上游启动子鉴定  29-32
    2.2.2 回复突变菌株全基因组测序及SNP基因救活实验结果  32-33
    2.2.3 回复突变菌株基因组测序结果  33-39
  2.3 讨论  39-41
第三章抑制高表达Sptrz2~+致死表型的基因的筛选  41-57
  3.1 实验材料  41-43
    3.1.1 菌种及质粒  41-43
    3.1.2 培养基及储存液  43
    3.1.3 主要试剂及耗材  43
  3.2 实验方法  43-46
    3.2.1 高表达trz2致死菌株的获得  43
    3.2.2 SPLE1文库质粒转化6381/4X-Sprtz2  43-44
    3.2.3 通过影印消耗维生素B1,使其表现出致死表型  44
    3.2.4 提取阳性转化子基因组,电转化获得能救活的文库质粒  44-46
  3.3 实验结果及分析  46-55
    3.3.1 影印后结果  46-47
    3.3.2 质粒酶切电泳图谱  47
    3.3.3 测序结果及分析  47-50
    3.3.4 Pm测序结果  50-53
    3.3.5 测序结果及酶切验证结果  53-55
  3.4 讨论  55-57
第四章检测已知的候选基因对温敏菌株的救活作用  57-64
  4.1 材料与方法  57-60
    4.1.1 材料  57
    4.1.2 方法  57-60
  4.2 结果  60-62
    4.2.1 yZZTS1的trz1基因存在额外的突变位点  60
    4.2.2 rex2和pnu1都无法救活yZZTS1  60-61
    4.2.3 yGW1的trz2突变位点的确在A623V  61-62
    4.2.4 未发现转入的质粒能弥补trz2A623V温度敏感缺陷表型  62
  4.3 讨论  62-64
参考文献  64-69
附录一主要仪器  69-70
附录二本实验所用的酵母菌株  70-71
附录三本实验所用的质粒  71-73
附录四本实验所用的引物  73-75
致谢  75

粟酒裂殖酵母编码tRNA3\'末端加工酶基因trz1回复突变基因研究

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