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shRNA表达库构建方法研究

作　者: 郭强
导　师: 陈薇；徐俊杰
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 小发夹RNA microRNA RNA干扰 RNA干扰库 shRNA表达库慢病毒载体
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


本论文针对shRNh表达库的构建做了三方面的工作：1、对现有的酶切法从cDNA构建shRNA表达库进行了改进，在降低技术难度的同时增加了库的复杂度：2、开发了一种新的建库方法构建了随机shRNA表达库，为使用shRNA表达库进行功能基因的筛选提供了另一种选择；3、研究了使用酶切法构建cDNA来源的第二代shRNA表达库和使用作者开发的方法构建第二代随机shRNA表达库的可行性。本研究从二个方面对酶切法进行了改进。首先我们增加了一种限制性内切酶CviKⅠ-1，我们随机挑选了9种来自人和小鼠的cDNA来统计其上的酶切位点的分布，结果发现原方案使用的那几种酶(HinpⅠ(GCGC)，BsaHⅠ(GPuCGPyC)，AciⅠ(AACGTT)，HpaⅡ(CCGG)，HDyCH4Ⅳ(ACGT)and TaqαⅠ(TCGA))的位点分布很少，平均每Kb共存在5.4个酶切位点。而CviKⅠ-1酶切位点的分布为每Kb存在20个酶切位点。由此可知，原方案使用的那几种内切酶在实际的操作中会导致较低的库的复杂度，其在EGFP上酶切位点的较多分布只是一个特例。而增加CviKⅠ-1则可以使库的复杂度得到较大的提高。此外，我们使用直接乙醇沉淀法对PAGE凝胶中扩散出的50bp的小片段进行回收。与原方案的柱回收相比，直接乙醇沉淀法可以得到较高的回收浓度和回收率，我们将该方法回收的片段用于下一步的连接和PCR实验中。发现该方法得到的DNA样品不会对这些操作产生不利的影响。这两点改进使我们在降低技术难度的同时能够得到较高的复杂度。本课题开发了一种新的方法，构建了一种新型的shRNA表达库—随机shRNA表达库。首先我们将人U6启动子插入慢病毒表达载体构建了shRNA的表达载体，由于建库方法的要求，在启动子序列中引入了XhoⅠ酶切位点。使用已知的针对EGFP的shRNA，我们检测了启动子序列的改变和建库所使用的shRNA loop对shRNA干扰活性的影响。经过三步操作，化学合成的19nt随机脱氧核苷酸片段能够被转化为双链的shRNA编码模版，然后将其克隆到表达载体中。转化后随机挑选20个克隆进行测序，发现库的复杂度可以达到1.1×107，这意味着针对一个1kb的mRNA，库中会有110条针对它的shRNA存在。与酶切法构建的cDNA来源的shRNA表达库相比，随机库有着许多的优点。这种随机库的构建为使用shRNA表达库进行功能基因的筛选提供了另一种选择。使用酶切法将cDNA片段插入miRNA的框架之中时，需要对miRNA的侧翼序列，茎部的长度进行一定的改变，构建随机的shRNA表达库也需要改变miRNA的侧翼序列。为了弄清楚这些改变是否会对miRNA的加工成熟及RISC的装配产生影响，本课题利用绿色荧光蛋白作为报告系统，构建了针对EGFP的shRNA-mir的三种突变体，一种是侧翼序列突变体，另外两种是茎部长度突变体，研究了这些改变对最终RIgA干扰效果的影响。结果表明，侧翼序列的改变对shRNA-mir的干扰活性没有影响，而茎部长度的增加，即使是仅有3bp的增加，都会对shRNA-mir的干扰活性造成完全的破坏，因此，构建随机shRNA-mir表达库在技术上是可行的，而目前的酶切法构建cDNA来源的shRNA-mir表达库是不可行的，必须对原方法加以改进。

全文目录


中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
引言  9-14
第一部分 酶切法的改进  14-26
  1 材料和方法  16-20
  2 结果  20-24
  3 讨论  24-26
第二部分 基于慢病毒载体的随机shRNA表达库的构建  26-37
  1 材料和方法  26-30
  2 结果  30-35
  3 讨论  35-37
第三部分 构建随机shRNA-mri表达库和cDNA 来源的shRNA-mir表达库的可行性研究  37-45
  1 材料和方法  37-40
  2 结果  40-42
  3 讨论  42-45
结论  45-46
参考文献  46-52
论著一  52-59
论著二  59-64
个人简历  64-65
致谢  65

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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