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水稻三个NPR1-like基因的克隆和功能研究

作　者: 袁月星
导　师: 何祖华
学　校: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
专　业: 分子遗传学
关键词: 水稻 NPR1基因基因表达转基因突变体细胞死亡 SA途径 JA途径 SA合成
分类号: Q943
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

利用水稻基因组测序计划的成果,使用蛋白的保守域,从水稻中分离出了三个与拟南芥抗病反应关键调控基因AtNPR1结构类似的锚蛋白重复序列蛋白基因,分别命名为OsNPR1,OsNPR2,OsNPR3。其中OsNPR1与AtNPR1的同源性最高。研究了这3个基因在不同的抗病反应相关信号分子诱导下的表达情况和基因的组织特异性表达情况。OsNPR1和OsNPR3都受BTH与ET和JA的诱导,而OsNPR2受BTH诱导,在JA处理下则表达量下降。OsNPR1与OsNPR3在细菌病害白叶枯病与水稻的不亲和反应(即抗病)中的诱导强度和速度都高于亲和反应(即感病)。而OsNPR2的表达没有明显变化。OsNPR1在真菌病害稻瘟病与水稻的不亲和反应(即抗病)中的诱导强度和速度都要高于亲和反应(即感病);OsNPR2与OsNPR3基因的表达则没有发现有规律性。将这3个基因的genomic DNA和cDNA在水稻中分别过量表达后(overexpression, OX),OsNPR1-OX的转基因植株显著增强了对白叶枯病的抗性,其对白叶枯病的抗性与OsNPR1基因的表达量呈正相关,即存在剂量效应。OsNPR2和OsNPR3的过量表达植株没有表现出抗病性的增加,而OsNPR3-OX转基因植株表现出耐盐特性。此外OsNPR1-OX的植株表现自发细胞死亡和株高降低的表型。用RNAi技术将OsNPR1基因沉默后,转基因植株对白叶枯病菌更为感病。OsNPR1基因可以互补拟南芥npr1-1突变体,证实OsNPR1基因是AtNPR1的ortholog基因。OsNPR1-GFP融合蛋白定位于转基因植株的细胞质。而将保守的参与形成NPR1多聚体的半胱氨酸位点突变后,OsNPR1(C76A+C216A)-GFP融合蛋白由多聚体解聚形成单体并进入细胞核。OsNPR1-GFP-OX与OsNPR 1(C76A+C216A)–GFP-OX转基因水稻对白叶枯病的抗性增强没有OsNPR1-OX显著,也没有细胞死亡的表型。这些转基因构建对下游PR基因的调控是相同的,即OsNPR1-OX和OsNPR1-GFP-OX都表现出某些受JA诱导的基因的表达量下降的现象,而它们对水稻虫害的抗性随之下降;OsNPR1(C76A+C216A)-GFP-OX转基因水稻中一些受SA(或其类似物BTH)调控基因的表达量上升。这些结果说明单子叶植物水稻中存在着类似于双子叶植物拟南芥中SA依赖的抗病反应途径,并且SA途径的加强抑制了JA途径。但与拟南芥SA的抗病途径有所差别,OsNPR1对水稻抗病性的调节可能是OsNPR1-OX诱导的细胞死亡启动的。OsNPR1基因在水稻细胞的不同部位表达还调控了水稻SA的浓度和存在形式,表明OsNPR1基因可能还通过某种未明确的机制调控了水稻内源SA的合成和代谢途径。

全文目录

综述植物抗病反应的信号传导  5-32
  一、植物病理过程的生化与分子遗传基础  5-17
    1 植物抗病性的遗传基础  5-6
    2 R 蛋白和Avr 蛋白(分子)的互作和抗性反应激发  6-9
    3 植物防卫的细胞、生化和分子生物学反应  9-17
  二、拟南芥AtNPR1 基因与SAR  17-25
    1 npr1 突变体的发现与基因的克隆  17-19
    2 AtNPR1 与TGA 转录因子互作以执行其功能  19-21
    3 细胞内的氧化还原状态可以调控NPR1 蛋白的存在形式  21-22
    4 参与SAR 反应中的其它调控因子  22-23
    5 AtNPR1 可能参与SAR 途径与其它抗病反应途径的互作  23-25
  三、水稻抗病反应研究进展  25-32
    1 水稻抗病基因的克隆与功能研究  25-26
    2 水稻防卫反应和PR 基因  26-28
    3 SA 与水稻抗病抗逆反应及问题的提出  28-32
研究论文第一部分水稻三个NPR1-like 基因的克隆和功能研究  32-96
  摘要  32-34
  Abstract  34-36
  第一章水稻NPR1 基因的克隆及其结构和表达分析  36-50
    摘要  36-37
    Abstract  37-38
    引言  38-41
    实验结果  41-48
    讨论  48-50
  第二章水稻NPR1-Like 基因的功能研究  50-66
    摘要  50-51
    Abstract  51-52
    引言  52-53
    实验结果  53-64
    讨论  64-66
  第三章 OsNPR1 蛋白及其突变体的亚细胞定位与抗病性  66-77
    摘要  66-67
    Abstract  67-68
    引言  68-69
    实验结果  69-75
    讨论  75-77
  第四章 OsNPR1 基因对PR基因表达影响  77-96
    摘要  77-78
    Abstract  78-79
    引言  79-81
    实验结果  81-93
    讨论  93-96
研究论文第二部分 Xa21 介导的抗病性的分子机制探讨—博士期间所做的其它工作  96-121
  引言  96
  实验结果  96-101
    1 XA21-GFP 融合蛋白在定位于细胞膜上  96-98
    2 Xa21-GFP-OX 转基因植株基因的功能研究  98-101
  讨论  101-102
  实验材料与方法  102-121
    实验材料  102-103
    实验方法  103-121
      1 农杆菌介导的水稻基因转化与转基因苗的鉴定  103-106
      2 OsNPR1 基因互补拟南芥 npr1-1 突变体  106-108
      3 其它分子生物学方法  108-116
      4 水稻 NPR1-like 基因功能研究  116-119
      5 细胞生物学实验  119-121
附表本实验所用部分引物和 PCR 反应条件  121-122
参考文献  122-133
致谢  133-134

水稻三个NPR1-like基因的克隆和功能研究

内容摘要

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