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猪精液冷冻保存研究

作　者: 胡建宏
导　师: 李青旺
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪精液冷冻保存冷冻保护剂精子质量 DNA损伤
分类号: S828
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

人工授精是一项发挥优秀公畜遗传潜力的重要现代动物生物技术,而精液冷冻的目的正是为了提供人工授精所需精子产品的一种精子库。冷冻以后精子的受精能力是保障哺乳动物高妊娠率的重要因素,与冷冻-解冻后精子质量密切相关。在复杂的冷冻-解冻过程中,精子细胞的生化成分和内部结构可能发生改变,致使目前猪精液冷冻保存的效果不够理想。冷冻-解冻后,精子活力、质膜完整性、顶体完整率以及发育能力远远不如鲜精,利用冷冻精液人工授精后母猪较低的繁殖率及较少的窝产仔数等导致猪冷冻精液不能应用于商品化养猪生产。因此,精子冷冻的首要目标,包括稀释液的应用、糖类的选择以及精液的冷冻-解冻程序等,都需要阻止对精子产生危害的致命冰晶的形成,以提高精子活力、活率,降低冷冻对精子顶体和质膜的损伤。为了保护精子免遭低温打击,卵黄在家畜冷冻精液中普遍应用,且其保护作用归功于低密度脂蛋白。关于卵黄低密度脂蛋白对牛和鱼精子冷冻保护的研究已有报道,但是没有研究评估低密度脂蛋白对猪冷冻精液活力和其它质量指标的影响。葡萄糖和果糖等添加物对哺乳动物冷冻-解冻后精子活率的影响报道较多,海藻糖、蔗糖和乳糖等双糖对小鼠、牛、绵羊和山羊精子冷冻-解冻后精子运动能力和受精能力也有一些报道,但是迄今为止,关于海藻糖对冷冻-解冻后猪精液质量的影响没有系统的研究报道。此外,在冷冻精液的生产中,精子细胞面临许多潜在的危险。精液的稀释、孵育,精子染色,荧光、精液的离心以及冷冻等,可能损伤精子DNA,影响精子的存活能力和受精潜力。然而猪精液不同的处理程序和技术对精子DNA完整性的影响几乎没有研究报道。为了进一步提高冷冻-解冻后猪精液的质量,保护精子抵抗低温打击的能力,开发中草药冷冻保护剂,本研究以蛋黄低密度脂蛋白(LDL)、双糖(海藻糖、蔗糖、乳糖)、中草药添加剂等作为冷冻保护剂,以冷冻解冻后精子的活率、活力、线粒体活性、质膜完整性、顶体完整率、精卵体外受精的卵裂率作为评定标准,利用碘化丙啶(PI)、罗丹明123、异硫氰酸荧光素连接的花生凝集素(FITC-PNA)、氯四环素(CTC)染色以及低渗膨胀测试(HOST)分别检测冷冻-解冻后精子的活率、染色线粒体活性、顶体完整率、获能处理前获能率、获能潜力以及质膜完整性,同时研究了猪细管冷冻精液的冷冻温度曲线、常温保存液预处理与冷冻基础液之间的配伍效应、冷冻-解冻对精子DNA的损伤以及精子体外受精卵裂率与精液参数(精子活率、活力、线粒体活性、质膜完整性、顶体完整率)之间的相关和回归关系。结果表明:

全文目录

摘要  4-8
ABSTRACT  8-17
文献综述  17-48
  第一章精液冷冻保存的机理  17-24
    1.1 精子细胞的特殊性  17
    1.2 精液冷冻保存机理  17-24
      1.2.1 精液冷冻保存的理论基础  18-19
      1.2.2 冷冻对细胞的损伤  19-20
      1.2.3 精液冷冻过程中的变化  20-22
      1.2.4 玻璃化冻结的保护作用  22-24
  第二章家畜精液冷冻保存技术研究进展  24-30
    2.1 精液冷冻保存的发展简况  24-25
    2.2 精液冷冻保存的现状  25-26
    2.3 精液的冷冻过程  26-28
      2.3.1 降温  26-27
      2.3.2 冷冻与细胞损伤  27-28
    2.4 精液稀释液中的添加剂  28-30
      2.4.1 咖啡因  28
      2.4.2 氨基多糖类  28
      2.4.3 己酮可可碱  28-29
      2.4.4 生殖激素  29
      2.4.5 细胞因子  29
      2.4.6 维生素  29-30
  第三章猪精液冷冻保存研究进展  30-34
    3.1 猪精液冷冻保存研究的发展简况  30-31
    3.2 猪冷冻精液的稀释液  31
    3.3 猪精液冷冻的冷冻保护剂  31-32
    3.4 冷冻对猪精子的损伤  32-33
    3.5 猪精子冷冻损伤的机理  33-34
  第四章家畜精液品质评定方法研究进展  34-41
    4.1 精子活率  34-35
    4.2 精子活力  35
    4.3 精子质膜完整性  35-37
    4.4 精子顶体完整性  37-38
      4.4.1 电镜观察法  37-38
      4.4.2 荧光染色法  38
    4.5 精子线粒体活性  38-39
    4.6 精子获能与 Ca~(2+)内流  39
    4.7 精子受精能力检测  39-41
  第五章猪精液质量评定技术研究进展  41-48
    5.1 精液品质评定的最终标准  41-42
    5.2 精液品质评定的常规指标  42-43
      5.2.1 精子密度  42
      5.2.2 精子的形态学特征  42
      5.2.3 精子活率  42
      5.2.4 精子质量评定的其他指标  42-43
    5.3 精子质量评定的新方法  43-48
      5.3.1 精子质膜完整性  43-44
      5.3.2 精子核 DNA 完整性  44-45
      5.3.3 精子线粒体功能  45
      5.3.4 精子获能  45-46
      5.3.5 顶体完整性  46
      5.3.6 精子受精能力  46-48
试验研究  48-144
  第六章猪精液冷冻技术研究  50-69
    第一节猪细管精液冷冻温度曲线研究  50-60
      6.1.1 材料与方法  51-53
      6.1.2 结果与分析  53-55
      6.1.3 猪细管冻精的冷冻温度曲线  55-58
      6.1.4 结论与讨论  58-60
    第二节猪精液预处理稀释液与冷冻基础液配伍效应研究  60-69
      6.2.1 材料与方法  61-64
      6.2.2 结果与分析  64-67
      6.2.3 讨论与结论  67-69
  第七章猪精液冷冻保护剂研究  69-106
    第一节蛋黄低密度脂蛋白对猪精子冷冻保存的影响  69-80
      7.1.1 材料与方法  72-74
      7.1.2 结果与分析  74-77
      7.1.3 讨论与结论  77-80
    第二节海藻糖、蔗糖和乳糖对猪精子冷冻保存的影响  80-92
      7.2.1 材料与方法  82-84
      7.2.2 结果与分析  84-91
      7.2.3 结论与讨论  91-92
    第三节猪精液中草药冷冻保护剂研究  92-106
      7.3.1 材料与方法  95-97
      7.3.2 结果与分析  97-102
      7.3.3 讨论  102-106
  第八章冷冻对猪精子遗传物质的影响  106-123
    第一节冷冻对猪精子染色质结构的影响  106-113
      8.1.1 材料与方法  109-110
      8.1.2 结果与分析  110-112
      8.1.3 结论与讨论  112-113
    第二节超低温冷冻对猪精子核 DNA 完整性的影响  113-123
      8.2.1 材料与方法  116-119
      8.2.2 结果与分析  119-121
      8.2.3 讨论  121-123
  第九章猪精液冷冻后体外受精能力研究  123-144
    第一节猪冷冻精子体外受精能力研究  123-132
      9.1.1 材料与方法  125-127
      9.1.2 结果与分析  127-130
      9.1.3 讨论  130-132
    第二节猪精子体外受精能力与精液参数的关系研究  132-144
      9.2.1 材料与方法  134-136
      9.2.2 结果与分析  136-141
      9.2.3 结论与讨论  141-144
结论  144-147
参考文献  147-168
附表  168-170
附图  170-178
致谢  178-179
个人简介  179-183

猪精液冷冻保存研究

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