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香烟水溶性提取物对心、脑和血管内皮的毒性损害以及相关机制的研究

作　者: 杨玉梅
导　师: 刘耕陶
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 药理学
关键词: 线粒体呼吸香烟烟气尼古丁心肌线粒体超微弱化学发光细胞色素脑线粒体吸烟者线粒体肿胀毒性作用
分类号: R114
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

香烟烟气中的很多化合物吸收进入血液循环后，将会作用于心脑和血管，造成损伤，吸烟是诱发心血管病和癌症的一种重要环境有害因素。流行病学的研究证明，吸烟与心血管疾病的发生和病情的进展明确相关。吸烟会使冠心病死亡率上升约20％-70％。同时也发现，胎儿期暴露于环境香烟烟气中，可能对大脑发育产生毒性作用，并且引起新生儿猝死综合征。吸烟会对大脑结构和功能以及儿童生理和认知功能的成长持续产生有害影响。吸烟者也会使患帕金森病的危险性增加。但是香烟烟气中具体的致病毒物，以及这些毒物如何引起血管损伤，目前所知甚少。线粒体是细胞氧化磷酸化产生ATP的关键部位，研究表明，香烟烟气残留物与线粒体共同孵育，会引起线粒体内膜破裂，与细胞呼吸活性的丧失和细胞死亡关系密切。并且已经有研究表明，吸烟可诱发心肌线粒体呼吸抑制，引起吸烟性心肌病。这提示，线粒体也可能成为香烟烟气毒性作用的靶点。为探讨吸烟对心脑及血管的毒性损害，并寻找可能的防治药物，本文进行了下列五方面的研究。首先研究了香烟水溶性提取物(CSE)对小鼠的急性和慢性毒性，继而研究了小鼠暴露于CSE和尼古丁引起的心、脑和血管线粒体结构和功能的损伤。鉴于，氧自由基引起的过氧化损伤，被认为可能是香烟烟气毒性损伤的重要机制之一，故观察CSE引起的线粒体毒性与氧化应激的关系，以及抗氧化剂是否有保护作用。最后，我们研究CSE和尼古丁对原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的损伤作用，以及CSE诱导HUVEC凋亡作用和相关的机制。有关结果分述如下：第一部分：香烟水溶性提取物对小鼠急性和慢性的毒性作用

全文目录

目录  3-6
缩略词表  6-7
中文摘要  7-12
英文摘要  12-19
第一部分：香烟水溶性提取物对小鼠急性和慢性的毒性作用  19-33
  前言  19
  材料和方法  19-23
    1.动物和试剂仪器  19-20
    2.香烟水溶性提取物(CSE)的制备  20
    3.CSE静脉注射对小鼠的急性毒性试验  20
    4.小鼠对CSE慢性经皮注射的毒性试验  20
    5.小鼠血浆vWFAg水平的测定  20-21
    6.血浆脂质过氧化物丙二醛(MDA)水平的测定  21-22
    7.小鼠全血谷胱甘肽过氧化物酶活性测定  22
    8.观察CSE对小鼠血浆超微弱化学发光水平的影响  22
    9.体内微核试验  22
    10.电镜观察  22
    11.统计分析  22-23
  结果  23-28
    1.急性毒性试验  23
    2.慢性毒性  23
    3.体内微核试验和病理组织检查  23
    4.透射电镜  23-28
  讨论  28-31
  参考文献  31-33
第二部分：香烟水溶性提取物慢性经皮注射引起小鼠心肌损伤  33-43
  前言  33
  材料和方法  33-37
    1.动物和试剂仪器  33-34
    2.香烟水溶性提取物(CSE)的制备  34
    3.慢性经皮注射CSE对小鼠毒性试验  34
    4.小鼠心肌线粒体的制备  34-35
    5.细胞色素C氧化酶活性测定  35
    6.血清GOT,LDH和CPK的测定  35
    7.透射电镜观察  35-37
  结果  37-40
    1.CSE暴露对小鼠心肌线粒体细胞色素C氧化酶(COX)活性的影响  37
    2.心肌损伤标志酶测定  37
    3.心肌线粒体形态学观察  37-40
  讨论  40-42
  参考文献  42-43
第三部分：香烟水溶性提取物对体外小鼠脑线粒体的损伤和维生素C的作用  43-62
  前言  43
  材料和方法  43-48
    1.动物和试剂  43-44
    2.香烟水溶性提取物(CSE)的制备  44
    3.小鼠脑线粒体制备  44-45
    4.线粒体ATPase酶活性的测定  45
    5.细胞色素C氧化酶(COX)活性的测定  45-46
    6.线粒体膜脂质过氧化物丙二醛(MDA)水平的测定  46
    7.线粒体膜脂质流动性的测定  46
    8.超微弱化学发光观察线粒体膜脂质和线粒体DNA过氧化反应  46-47
    9.线粒体肿胀度的测定  47
    10.透射电镜观察线粒体形态学变化  47
    11.统计分析  47-48
  结果  48-57
    1.CSE或尼古丁对小鼠脑线粒体呼吸酶活性,MDA水平和线粒体膜脂质流动性的影响  48
    2.CSE或尼古丁对小鼠脑线粒体和线粒体DNA超微弱化学发光强度的影响  48
    3.CSE或尼古丁对Ca~(2+)诱导的小鼠脑线粒体肿胀反应的影响  48-49
    4.线粒体形态学的透射电镜分析  49-57
  讨论  57-59
  参考文献  59-62
第四部分：香烟水溶性提取物对大鼠心肌线粒体损伤作用  62-73
  前言  62
  材料和方法  62-66
    1.动物和试剂  62-63
    2.香烟水溶性提取物(CSE)的制备  63
    3.心肌线粒体制备  63
    4.线粒体ATPase酶活性的测定  63-64
    5.细胞色素C氧化酶(COX)活性的测定  64
    6.线粒体膜脂质过氧化物丙二醛(MDA)水平的测定  64
    7.线粒体膜脂质流动性的测定.  64
    8.超微弱化学发光观察线粒体膜脂质和线粒体DNA过氧化反应  64-65
    9.线粒体肿胀度的测定  65
    10.统计分析  65-66
  结果与讨论  66-71
    1.CSE和尼古丁对大鼠心肌线粒体ATPase、COX活性、MDA水平及线粒体膜脂质流动性的影响  66
    2.CSE和尼古丁作用于大鼠心肌线粒体悬液以及线粒体DNA超微弱化学发光强度的观察  66-69
    3.CSE对钙离子诱导的线粒体肿胀反应的影响  69-71
  结论  71-72
  参考文献  72-73
第五部分：香烟水溶性提取物对原代培养的人脐静脉内皮细胞的损伤作用  73-98
  前言  73
  材料和方法  73-78
    1.试剂  73-74
    2.香烟水溶性提取物(CSE)的制备  74
    3.细胞培养  74
    4.HUVEC存活率和增殖率  74-75
    5.HUVEC凋亡和细胞周期分析  75
    6.相差显微镜和荧光显微镜观察HUVEC形态学变化  75
    7.HUVEC血管形成.  75-76
    8.罗丹明123测定线粒体膜电位  76
    9.Fura 2测定细胞内游离Ca~(2+)浓度  76
    10.流式细胞分析HUVEC p53,Bcl-2／Bax蛋白的表达  76
    11.Western blot分析HUVEC Bcl-2表达  76-77
    12.统计分析  77-78
  结果  78-92
    1.CSE或尼古丁对HUVEC存活率和增殖率的影响  78
    2.流式细胞分析CSE或尼古丁处理HUVEC凋亡及细胞周期分布  78-82
    3.CSE或尼古丁暴露引起的HUVEC形态学变化  82
    4.CSE或尼古丁对HUVEC血管形成的影响  82-86
    5.线粒体膜电位和胞浆游离钙离子浓度的测定  86
    6.HUVEC凋亡相关蛋白的表达  86-92
  讨论  92-95
  参考文献  95-98
综述  98-106
总结与展望  106-111
致谢  111-112
简历  112

香烟水溶性提取物对心、脑和血管内皮的毒性损害以及相关机制的研究

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