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丙烯腈/马来酸共聚物膜与脂肪酶的固定化

作　者: 叶鹏
导　师: 徐志康
学　校: 浙江大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 丙烯腈/马来酸共聚物 中空纤维膜 酶固定化 脂肪酶 表面改性 壳聚糖 明胶 静电纺丝
分类号: TB383.2
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


丙烯腈/马来酸共聚物中空纤维膜表面带有活性基团—羧基,适合用作酶固定化的载体材料。但是作为一种合成聚合物,这种膜材料存在着生物相容性较差等缺点,使得酶分子与载体材料间会产生非生物特异性相互作用,从而导致酶的失活。为了提高固定化酶的活性,本论文采用表面仿生修饰的方法,将天然大分子壳聚糖和明胶分别引入到丙烯腈/马来酸共聚物中空纤维膜表面,在膜材料表面构建仿生修饰层,为脂肪酶(来源于Candida rugosa)营造一种生物友好的微环境,使酶的活性提高。另一方面,通过静电纺丝技术制备了丙烯腈/马来酸共聚物纳米纤维膜,并以其作为脂肪酶的固定化载体,利用其极高的比表面积,提高固定化酶的载酶量。最后,将这两种方法进行有机结合,即用天然大分子壳聚糖和明胶分别修饰丙烯腈/马来酸共聚物纳米纤维膜,并探讨其作为脂肪酶固定化载体材料的特点。具体内容如下: 制备了丙烯腈/马来酸共聚物中空纤维膜,用碳二亚胺法活化膜表面羧基,在载体与酶分子之间形成共价键,实现了脂肪酶的固定化。分别研究了固定化对脂肪酶在水相介质和正庚烷中的催化活性、反应动力学参数和稳定性的影响。发现,与自由酶相比,在水相介质中,固定化酶的活性下降,酶活性保留值为33.9%;在正庚烷中,固定化酶的活性增加,酶活性保留值为114%。固定化酶的载酶量为53.7±1.4mg/m~2。固定化后,酶的稳定性明显提高,其中在50℃下处理120min后,固定化酶仍有62%的活性。 将壳聚糖用碳二亚胺法引入到丙烯腈/马来酸共聚物中空纤维膜的表面,用全反射傅立叶变换红外光谱(ATR/FT-IR)和X-射线光电子能谱(XPS)表征了膜材料表面的化学变化。分别用戊二醛法和吸附法两种方法将脂肪酶固定于壳聚糖修饰的膜材料表面,研究了壳聚糖修饰对固定化脂肪酶活性、载酶量、反应动力学参数和稳定性的影响。结果显示,壳聚糖修饰后,膜材料表面生物相容性得到改善,固定化酶的活性提高:戊二醛法为44.5%,吸附法为54.1%。固定化酶的载酶量:戊二醛法为66.5±1.8 mg/m~2,吸附法为31.2±1.6 mg/m~2。两种固定化酶都表现出较高的稳定性,其中热稳定性:戊二醛法为65%,吸附法为38%。 将明胶用碳二亚胺法引入到丙烯腈/马来酸共聚物中空纤维膜的表面,用

全文目录


摘要  12-14
Abstract  14-17
第一章 绪论  17-41
  §1.1 酶的固定化技术  17-28
    §1.1.1 酶固定化的方法  17-21
      §1.1.1.1 吸附法  18
      §1.1.1.2 共价结合法  18-19
      §1.1.1.3 交联法  19-20
      §1.1.1.4 包埋法  20
      §1.1.1.5 新型的固定化方法  20-21
    §1.1.2 酶固定化的载体材料  21-28
      §1.1.2.1 无机材料  22
      §1.1.2.2 天然大分子  22-25
      §1.1.2.3 合成高分子  25-26
      §1.1.2.4 膜材料  26-28
        §1.1.2.4.1 平板膜  26-27
        §1.1.2.4.2 中空纤维膜  27
        §1.1.2.4.3 静电纺丝膜  27-28
  §1.2 酶膜的应用  28-35
    §1.2.1 酶膜生物反应器  28-29
    §1.2.2 生物传感器  29-30
    §1.2.3 固定化脂肪酶膜  30-35
      §1.2.3.1 脂肪酶简介  30-34
      §1.2.3.1 固定化脂肪酶膜的应用  34-35
  §1.3 聚丙烯腈膜表面的酶固定化  35-37
    §1.3.1 膜表面修饰法  35-36
    §1.3.2 共聚法  36-37
  §1.4 课题的提出  37-41
    §1.4.1 课题的意义  37-39
    §1.4.2 课题实验方案  39-41
      §1.4.2.1 脂肪酶在丙烯腈／马来酸共聚物中空纤维膜上的固定化  39
      §1.4.2.2 脂肪酶在壳聚糖修饰的丙烯腈／马来酸共聚物中空纤维膜上的固定化  39
      §1.4.2.3 脂肪酶在明胶修饰的丙烯腈／马宋酸共聚物中空纤维膜上的固定化  39
      §1.4.2.4 丙烯腈／马来酸共聚物纳米纤维膜的制备及脂肪酶的固定化  39-40
      §1.4.2.5 脂肪酶在天然大分子修饰的丙烯腈／马来酸共聚物纳米纤维膜上的固定化  40-41
第二章 脂肪酶在丙烯腈／马来酸共聚物中空纤维膜上的固定化  41-63
  §2.1 前言  41-42
  §2.2 实验部分  42-50
    §2.2.1 实验原料与仪器  42-43
      §2.2.1.1 实验原料  42-43
      §2.2.1.2 实验仪器  43
    §2.2.2 丙烯腈／马来酸共聚物中空纤维膜的制备  43-44
      §2.2.2.1 丙烯腈／马来酸共聚物的合成  43
      §2.2.2.2 中空纤维膜的制备  43-44
    §2.2.3 脂肪酶的固定化  44
      §2.2.3.1 EDC／NHS法活化膜材料  44
      §2.2.3.2 酶的固定化  44
    §2.2.4 脂肪酶载酶量的测定  44-45
      §2.2.4.1 Bradford方法检测溶液中蛋白含量  44-45
      §2.2.4.2 BSA标准曲线的绘制  45
      §2.2.4.3 载酶量的确定  45
    §2.2.5 脂肪酶活性的测定  45-48
      §2.2.5.1 水相介质中脂肪酶活性的测定  46-48
      §2.2.5.2 正庚烷中脂肪酶活性的测定  48
    2.2.6 脂肪酶稳定性的测定  48-50
      2.2.6.1 热稳定性的测定  48-49
      2.2.6.2 pH稳定性的测定  49
      2.2.6.3 重复使用稳定性的测定  49-50
  §2.3 结果与讨论  50-61
    §2.3.1 固定化条件与酶活性的关系  50-52
      §2.3.1.1 碳二亚胺浓度的影响  50-51
      §2.3.1.2 酶液浓度的影响  51
      §2.3.1.3 酶液pH值的影响  51-52
    §2.3.2 酶的催化反应条件  52-53
      §2.3.2.1 催化反应最适pH  52
      §2.3.2.2 催化反应最适温度  52-53
    §2.3.3 脂肪酶的反应动力学参数  53-54
    §2.3.4 酶的稳定性  54-57
      §2.3.4.1 热稳定性  55-56
      §2.3.4.2 pH稳定性  56
      §2.3.4.3 重复使用稳定性  56-57
    §2.3.5 酶在有机介质中的催化活性  57-61
      §2.3.5.1 温度对酶活性的影响  57-58
      §2.3.5.2 含水量对酶活性的影响  58-60
      §2.3.5.3 酶的反应动力学参数  60-61
      §2.3.5.4 酶的重复使用稳定性  61
  §2.4 小结  61-63
第三章 脂肪酶在壳聚糖修饰的丙烯腈／马来酸共聚物中空纤维膜上的固定化  63-86
  §3.1 前言  63-64
  §3.2 实验部分  64-69
    §3.2.1 实验原料与仪器  64-66
      §3.2.1.1 实验原料  64-65
      §3.2.1.2 实验仪器  65-66
    §3.2.2 丙烯腈／马来酸共聚物中空纤维膜的制备  66
    §3.2.3 壳聚糖对丙烯腈／马来酸共聚物中空纤维膜的修饰  66
      §3.2.3.1 低分子量壳聚糖的制备  66
      §3.2.3.2 壳聚糖在中空纤维膜表面的接枝修饰  66
    §3.2.4 壳聚糖修饰膜表面化学结构的表征  66-67
      §3.2.4.1 衰减全反射傅立叶变换红外分析(ATP／FT-IR)  66-67
      §3.2.4.2 X-射线光电子能谱分析(XPS)  67
    §3.2.5 水接触角的测定  67
    §3.2.6 脂肪酶的固定化  67-68
      §3.2.6.1 戊二醛法  67-68
      §3.2.6.2 吸附法  68
    §3.2.7 固定化脂肪酶的脱附实验  68
    §3.2.8 脂肪酶载酶量的测定  68
      §3.2.8.1 Bradford方法检测溶液中蛋白含量  68
      §3.2.8.2 BSA标准曲线的绘制  68
      §3.2.8.3 载酶量的确定  68
    §3.2.9 脂肪酶活性的测定  68
    §3.2.10 脂肪酶稳定性的测定  68-69
      §3.2.10.1 热稳定性的测定  68
      §3.2.10.2 pH稳定性的测定  68-69
      §3.2.10.3 重复使用稳定性的测定  69
  §3.3 结果与讨论  69-84
    §3.3.1 壳聚糖修饰膜表面的化学结构表征  69-71
      §3.3.1.1 ATR／FT-IR分析  69-70
      §3.3.1.2 XPS分析  70-71
    §3.3.2 壳聚糖修饰膜接枝率的变化规律  71
    §3.3.3 膜表面水接触角的测定  71-72
    §3.3.4 戊二醛法固定化条件与酶活性的关系  72-74
      §3.3.4.1 戊二醛浓度的影响  72-73
      §3.3.4.2 酶液浓度的影响  73-74
      §3.3.4.3 酶液pH值的影响  74
    §3.3.5 脂肪酶在壳聚糖修饰膜表面的吸附  74-79
      §3.3.5.1 pH值对酶活性的影响  75-76
      §3.3.5.2 离子强度对载酶量的影响  76-77
      §3.3.5.3 酶溶液浓度对载酶量的影响  77-78
      §3.3.5.4 吸附时间对载酶量的影响  78
      §3.3.5.5 脱附实验  78-79
    §3.3.6 酶的催化反应条件  79-80
      §3.3.6.1 催化反应最适pH  79
      §3.3.6.2 催化反应最适温度  79-80
    §3.3.7 壳聚糖修饰对固定化脂肪酶的影响  80-81
    §3.3.8 脂肪酶的反应动力学参数  81-82
    §3.3.9 酶的稳定性  82-84
      §3.3.9.1 热稳定性  82-83
      §3.3.9.2 pH稳定性  83-84
      §3.3.9.3 重复使用稳定性  84
  §3.4 小结  84-86
第四章 脂肪酶在明胶修饰的丙烯腈／马来酸共聚物中空纤维膜上的固定化  86-102
  §4.1 前言  86-87
  §4.2 实验部分  87-90
    §4.2.1 实验原料与仪器  87-88
      §4.2.1.1 实验原料  87-88
      §4.2.1.2 实验仪器  88
    §4.2.2 丙烯腈／马来酸共聚物中空纤维膜的制备  88
    §4.2.3 明胶对丙烯腈／马来酸共聚物中空纤维膜的修饰  88-89
      §4.2.3.1 低分子量明胶的制备  88-89
      §4.2.3.2 明胶在中空纤维膜表面的接枝修饰  89
    §4.2.4 明胶修饰膜表面化学结构的表征  89
      §4.2.4.1 ATR／FT-IR分析  89
      §4.2.4.2 XPS分析  89
    §4.2.5 水接触角的测定  89
    §4.2.6 脂肪酶的固定化  89
    §4.2.7 脂肪酶载酶量的测定  89-90
      §4.2.7.1 Bradford方法检测溶液中蛋白含量  89
      §4.2.7.2 BSA标准曲线的绘制  89
      §4.2.7.3 载酶量的确定  89-90
    §4.2.8 脂肪酶活性的测定  90
    §4.2.9 脂肪酶稳定性的测定  90
      §4.2.9.1 热稳定性的测定  90
      §4.2.9.2 pH稳定性的测定  90
      §4.2.9.3 重复使用稳定性的测定  90
  §4.3 结果与讨论  90-100
    §4.3.1 明胶修饰膜表面的化学结构表征  90-92
      §4.3.1.1 ATR／FT-IR分析  90-91
      §4.3.1.2 XPS分析  91-92
    §4.3.2 明胶修饰膜接枝率的变化规律  92-93
    §4.3.3 膜表面水接触角的测定  93
    §4.3.4 固定化条件与酶活性的关系  93-95
      §4.3.4.1 戊二醛浓度的影响  93-94
      §4.3.4.2 酶液浓度的影响  94-95
      §4.3.4.3 酶液pH值的影响  95
    §4.3.5 酶的催化反应条件  95-96
      §4.3.5.1 催化反应最适pH  95-96
      §4.3.5.2 催化反应最适温度  96
    §4.3.6 明胶修饰对固定化脂肪酶的影响  96-97
    §4.3.7 脂肪酶的反应动力学参数  97-98
    §4.3.4 酶的稳定性  98-100
      §4.3.4.1 热稳定性  98-99
      §4.3.4.2 pH稳定性  99
      §4.3.4.3 重复使用稳定性  99-100
  §4.4 小结  100-102
第五章 静电纺丝法制备丙烯腈／马来酸共聚物纳米纤维膜及脂肪酶的固定化  102-117
  §5.1 前言  102-103
  §5.2 实验部分  103-106
    §5.2.1 实验原料与仪器  103-105
      §5.2.1.1 实验原料  103-104
      §5.2.1.2 实验仪器  104-105
    §5.2.2 静电纺丝法丙烯腈／马来酸共聚物纳米纤维膜的制备  105
    §5.2.3 扫描电镜(SEM)表征纳米纤维膜表面形貌  105
    §5.2.4 脂肪酶的固定化  105
      §5.2.4.1 EDC/NHS法活化载体  105
      §5.2.4.2 酶的固定化  105
    §5.2.5 脂肪酶载酶量的测定  105-106
      §5.2.5.1 Bradford方法检测溶液中蛋白含量  105-106
      §5.2.5.2 BSA标准曲线的绘制  106
      §5.2.5.3 载酶量的确定  106
    §5.2.6 脂肪酶活性的测定  106
    §5.2.7 脂肪酶稳定性的测定  106
      §5.2.7.1 热稳定性的测定  106
      §5.2.7.2 pH稳定性的测定  106
      §5.2.7.3 重复使用稳定性的测定  106
  §5.3 结果与讨论  106-115
    §5.3.1 静电纺丝法丙烯腈／马来酸共聚物纳米纤维膜的制备  106-109
      §5.3.1.1 纺丝液粘度的影响  107-108
      §5.3.1.2 电压的影响  108-109
    §5.3.2 固定化条件与酶活性的关系  109-111
      §5.3.2.1 碳二亚胺浓度的影响  109-110
      §5.3.2.2 酶液浓度的影响  110
      §5.3.2.3 酶液pH值的影响  110-111
    §5.3.3 酶的催化反应条件  111-112
      §5.3.3.1 催化反应最适pH  111
      §5.3.3.2 催化反应最适温度  111-112
    §5.3.4 载体材料物理结构改变对固定化脂肪酶的影响  112-113
    §5.3.5 脂肪酶的反应动力学参数  113-114
    §5.3.6 酶的稳定性  114-115
      §5.3.6.1 热稳定性  114
      §5.3.6.2 pH稳定性  114-115
      §5.3.6.3 重复使用稳定性  115
  §5.4 小结  115-117
第六章 脂肪酶在天然大分子修饰的丙烯腈／马来酸共聚物纳米纤维膜上的固定化  117-130
  §6.1 前言  117
  §6.2 实验部分  117-120
    §6.2.1 实验原料与仪器  117-119
      §6.2.1.1 实验原料  118-119
      §6.2.1.2 实验仪器  119
    §6.2.2 静电纺丝法丙烯腈／马来酸共聚物纳米纤维膜的制备  119
    §6.2.3 天然大分子对丙烯腈／马来酸共聚物纳米纤维膜的修饰  119
      §6.2.3.1 壳聚糖对纳米纤维膜的修饰  119
      §6.2.3.2 明胶对纳米纤维膜的修饰  119
    §6.2.4 脂肪酶的固定化  119
    §6.2.5 脂肪酶载酶量的测定  119-120
      §6.2.5.1 Bradford方法检测溶液中蛋白含量  119-120
      §6.2.5.2 BSA标准曲线的绘制  120
      §6.2.5.3 载酶量的确定  120
    §6.2.6 脂肪酶活性的测定  120
    §6.2.7 脂肪酶稳定性的测定  120
      §6.2.7.1 热稳定性的测定  120
      §6.2.7.2 pH稳定性的测定  120
      §6.2.7.3 重复使用稳定性的测定  120
  §6.3 结果与讨论  120-128
    §6.3.1 固定化条件与酶活性的关系  120-123
      §6.3.1.1 戊二醛浓度的影响  120-122
      §6.3.1.2 酶液浓度的影响  122-123
      §6.3.1.3 酶液pH值的影响  123
    §6.3.2 酶的催化反应条件  123-125
      §6.3.2.1 催化反应最适pH  123-124
      §6.3.2.2 催化反应最适温度  124-125
    §6.3.3 天然大分子修饰对固定化脂肪酶的影响  125-126
    §6.3.4 脂肪酶的反应动力学参数  126-127
    §6.3.5 酶的稳定性  127-128
      §6.3.5.1 热稳定性  127
      §6.3.5.2 pH稳定性  127-128
      §6.3.5.3 重复使用稳定性  128
  §6.4 小结  128-130
第七章 总结  130-134
参考文献  134-148
博士论文工作期间发表文章和科研成果  148-150
致谢  150

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