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内皮抑素及其噬菌体模拟肽抑制新血管形成研究

作　者: 冯玉梅
导　师: 周歧新；曾昭淳；马清钧
学　校: 重庆医科大学
专　业: 分子药理学
关键词: 内皮抑素 新血管形成 单克隆抗体 噬菌体展示技术 血管内皮生长因子 基质金属蛋白酶
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


内皮抑素(endostatin)是1997年由哈佛大学的O’Reilly等从小鼠血管内皮瘤细胞的培养上清液中首次分离的一种内源性新血管形成(angiogenesis)抑制因子。为获得深入研究内皮抑素的有力工具,我们以毕赤酵母表达的内皮抑素为免疫原,免疫BALB/c小鼠。采用B淋巴细胞杂交瘤技术,以间接ELISA法筛选并获得分泌抗人内皮抑素的特异性单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)的杂交瘤细胞株。该株杂交瘤细胞分泌的McAb属于IgG1(λ型),命名为McAb 4E7。腹水McAb的效价为1×10-4～1×10-6,纯化后效价大于1×10-10,免疫印迹结果显示McAb 4E7特异性的与酵母及大肠杆菌表达的内皮抑素发生反应,而与bFGF等其它细胞因子不发生交叉反应。进一步的生物学功能研究发现,McAb 4E7在体外实验中可拮抗内皮抑素抑制人脐静脉内皮细胞迁移和管化形成作用,并能阻断脐静脉内皮细胞对内皮抑素的粘附作用;另外,在动物模型实验中McAb 4E7可拮抗内皮抑素对角膜新血管形成的抑制作用。 由于内皮抑素作用机制尚不明确,最近的研究表明其分子中包含有抑制新血管形成及促进新血管形成的片段。因此,我们利用具有拮抗内皮抑素功能的McAb 来筛选噬菌体15肽文库,旨在获得有功能的内皮抑素15肽线性表位或模拟空间表位,为内皮抑素的作用机制研究及小分子模拟肽药物的设计提供实验基础。经过四轮筛选我们获得了一段具有保守序列的噬菌体展示肽;在体内、外实验中证实可以模拟内皮抑素的抑制内皮细胞管化形成和角膜新血管形成的生理活性。 本研究中,我们以小鼠角膜新血管形成为模型,检验重组人内皮抑素

全文目录


符号说明  6-9
中文摘要  9-11
英文摘要  11-13
前言  13-16
材料  16-19
  1. 引物合成及测序  16
  2. 细胞株、菌株、质粒  16-17
  3. 抗体  17
  4. 分子生物学工具酶  17
  5. 细胞培养用品  17
  6. 免疫试剂及免疫组化用品  17
  7. 酵母培养特殊试剂  17
  8. 蛋白纯化材料  17
  9. 常用缓冲液及细菌培养基  17-18
  10. 其他常规试剂  18
  11. 实验动物及标本  18
  12. 实验仪器  18-19
方法与步骤  19-33
  1. 重组蛋白在酵母宿主菌G5115 中诱导表达  19
  2. 重组内皮抑素的纯化与鉴定  19-20
  3. 蛋白浓度的测定（BCA 法）  20
  4. 鼠免疫B 淋巴细胞的制备  20
  5. 骨髓瘤细胞的培养  20-21
  6. 饲养细胞的制备  21
  7. 细胞融合与选择性培养  21
  8. 杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化  21-22
  9. 腹水型McAb 的制备与纯化  22
  10. 杂交瘤细胞染色体的计数  22-23
  11. 免疫共沉淀和免疫印迹（Western blot）  23
  12. BIAcore分析  23-24
  13. 总RNA 的提取与逆转录  24
  14. PCR 扩增  24-25
  15. 实时定量PCR  25
  16. 目的基因的克隆  25
  17. 质粒载体的鉴定与测序  25-26
  18. 标本采集  26
  19. 原代人脐静脉内皮细胞的分离、培养与鉴定  26-27
  20. 鼠角膜新血管形成模型的建立  27
  21. 角膜新血管长度的测量  27
  22. 细胞增殖试验  27-28
  23. 细胞粘附试验  28
  24. 细胞迁移分析  28-29
  25. 噬菌体滴度的测定  29
  26. 噬菌体的扩增与纯化  29
  27. 特异性结合噬菌体的生物淘洗  29-30
  28. 竞争ELISA 鉴定单克隆噬菌体展示肽的结合特异性  30
  29. 噬菌体单链DNA 的制备  30-31
  30. 人脐静脉内皮细胞血管化形成分析  31
  31. 明胶酶谱检测基质外金属蛋白酶活性  31
  32. 免疫组织化学分析  31-33
结果  33-61
  第一部分：鼠抗人内皮抑素单抗隆抗体的制备、鉴定与生物学功能研究-  33-49
    1. 重组人内皮抑素在毕赤酵母G5115 中的表达、纯化  33-36
    2. 鼠抗人内皮抑素单抗隆抗体的制备  36-38
    3. 鼠抗人内皮抑素单抗隆抗体的鉴定  38-43
    4. 鼠抗人内皮抑素单抗隆抗体4E7 拮抗内皮抑素的生物学活性  43-49
  第二部分：内皮抑素噬菌体模拟肽的筛选  49-56
    1. 抗人内皮抑素单抗McAb 4E7 结合噬菌体的富集  49
    2. 单克隆噬菌体对McAb 4E7 的竞争抑制ELISA 结果  49-51
    3. 测序结果  51
    4. 重组人内皮抑素及其模拟肽抑制新血管形成的生物活性研究  51-56
  第三部分：内皮抑素抑制碱烧伤诱导的角膜新血管形成机制的初步探讨-  56-61
    1. 内皮抑素促进碱烧伤角膜VEGF 的表达  56-57
    2. 内皮抑素促进碱烧伤角膜MMP-2 和MMP-9 的表达  57-61
讨论  61-69
  第一部分：与内皮抑素具有高亲合力并能拮抗其部分功能的单克隆抗体的制备  61-63
  第二部分：内皮抑素及其模拟短肽对碱烧伤诱导的角膜新血管形成的抑制作用  63-66
  第三部分：内皮抑素促进碱烧伤角膜MMP-2、MMP-9 和VEGF 的表达  66-69
结论与展望  69-71
参考文献  71-80
文献综述  80-88
博士期间参与发表的文章  88-89
博士期间的会议论文  89-90
致谢  90

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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