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拟南芥抗旱候选基因的SNP及其与抗旱性状的相关性分析以及ATHK1基因的功能研究

作　者: 郝岗平
导　师: 杨清；黄丛林
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 拟南芥 CBF4 ATHK1 NCED3 单核苷酸多态性(SNP) 抗旱性状相关分析 ATHK1突变体渗透感受器
分类号: Q943
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

本研究以生长于不同生态气候条件下的32个拟南芥核心生态型为材料，分析了它们的抗旱指标和综合抗旱性，同时通过直接测序法分析了抗旱转录因子CBF4，组氨酸蛋白激酶ATHK1和ABA合成关键酶基因NCED3的单核苷酸多态性(SNP)。结果表明，不同的拟南芥生态型具有差异明显的抗旱性，抗旱综合聚类分析将32个生态型聚合为4类：强抗旱、抗旱、中等抗旱和干旱敏感型。 CBF4基因位点核苷酸多态性的频率为每35.8bp一个SNP，每143 bp一个插入／缺失(Indel)。编码区SNP的频率为每96.4bp一个SNP，其中1034位(以GenBank No.AB015478序列第19696位的核苷酸为1)碱基变化：GT，引起第205位氨基酸变化：glyval。基因非编码区的多态性是编码区的4倍，表明编码区承受着更大的选择压力。Tajima’S D统计学检验结果是各区域都不显著，说明该区域核苷酸变化符合中性突变假说，较高的核苷酸多样性是净化选择的结果。相关性分析表明CBF4基因5′端非编码区的核苷酸变化与拟南芥综合抗旱性相关，氨基酸变化与综合抗旱性不相关。 ATHK1基因位点核苷酸多态性的频率为每142 bp一个SNP，每1705bp一个Indel。编码区SNP的频率为每190.6 bp一个SNP，非编码区SNP的频率为每87.9bp一个SNP，非编码区的多态性是编码区的2.17倍。Tajima’S D，Fu Li’D°test和Fu Li’F°test统计学检验结果表明ATHK1基因位点的整个区域和编码区显著，这说明编码区域核苷酸变化不符合中性突变假说，是自然正选择的结果。Ka／Ks的比率为0.727，说明ATHK1基因属于中等速度进化基因。相关性分析表明ATHK1基因5′非编码区的序列变化与抗旱综合能力可能没有相关性。257 av和266 av第1198位氨基酸Ser变为终止密码子可能与它们较低的综合抗旱性相关。 NCED3基因位点核苷酸多态性的频率为每87.4bp一个SNP，每502bp一个Indel。编码区SNP的频率为每94.6 bp一个SNP，非编码区SNP的频率为每51 bp一个SNP，基因非编码区的多态性是编码区的1.85倍。Tajima’S D，Fu Li’D°test和Fu Li’F°test统计学检验结果表明NCED3基因位点的整个区域和编码区不显著，5′端非编码区显著，这表明编码区域核苷酸变化符合中性突变假说，5′端非编码区的核苷酸变化不符合中性假说，可能有平衡性选择作用。整个编码区的Ka／Ks的比率为0.270，表明NCED3基因正经受较强的净化选择，属于相对保守基因。相关性分析表明157 av拟南芥抗早候选荃因的SN甲及其抗早性状的相关性分析以及才7了IKI基因的功能研究5‘非编码区第”位的A.C与170位的A.C可能与其较高的脱落酸(^BA冷t有关;2 57 avs‘非编码区的87位的C.T可能与其较低的杭早综合能力相关.163a，NCBD3蛋白质第46位氛基故cys“^rg的互换可能与^B人含童相关性较高.NcED3蛋白的氛基酸变化与各生态型的综合杭早性没有关系. 以拟南芥ws仪“5 1 lewskija)生态型及其才刀济2基因T一DN人插入所产生的缺失突变体为材料，分析了它们在生理和基因表达方面的差异.结果表明突变体的离体叶片失水率明显大于歼生型;在3。%PEG胁迫后，歼生型和才刀深了突变体的细胞膜离子外渗率比胁迫前分别增加了50%和80%.PEG一6000胁迫48h时突变体的英蔫程度明显大于歼生型ws.以上结果说明A刀澄I突变体的抗渗透胁迫能力低于野生型，即才劲盯基因参与了拟南芥适应逆境的调节反应.利用DDRT一PcR技术研究二者在PBG一6 000胁迫36h后的基因表达差异，分离到9个在野生型中被PEG诱导表达而在突变体中未被诱导的参与逆境应答的基因片段，其中包括蒯乃以了了矛和丝氛酸/苏氮酸蛋白激醉基因，即才刀澄2基因失活引起下游基因响应渗透胁迫的能力减弱，进一步说明A几澄1基因参与拟南芥适应逆境的调节反应，且ATHKI可能在逆境信号转导组分MAPK的上游起作用，很可能是植物中的渗透感受器.

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-13
文献综述  13-34
  第一节植物抗旱的鉴定方法及指标  14-17
  第二节植物抗旱育种中的分子标记辅助选择  17-20
  第三节植物对干旱的识别、逆境信使的转导以及分子响应  20-23
  第四节植物的单核苷酸多态性及其在作物遗传育种中的应用  23-30
  参考文献  30-34
第一部分拟南芥抗旱候选基因CBF4、ATHK1和NGED3的单核苷酸多态性及其与抗旱性状的相关性  34-142
  第一章前言  35-41
  第二章材料和方法  41-51
    1 材料  41-42
    2 方法  42-51
      2.1 与抗旱相关的一些生理指标分析方法  42-45
        2.1.1 叶片相对含水量测定  42
        2.1.2 叶片细胞膜伤害率测定  42
        2.1.3 水分利用效率测定  42
        2.1.4 离体叶片保水力测定  42
        2.1.5 盆栽控水形态学观察  42
        2.1.6 ABA含量的测定  42-44
        2.1.7 拟南芥综合抗旱性状的研究  44-45
      2.2 SNP多态性分析方法  45-51
        2.2.1 DNA提取  45-46
        2.2.2 拟南芥CBF4、ATHK1和NCED3基因引物设计及验证  46
        2.2.3 PCR扩增基因片段  46
        2.2.4 DNA序列测定  46-49
        2.2.5 DNA序列SNP的发现  49-50
        2.2.6 核苷酸序列多态性分析  50
        2.2.7 所测基因的序列变化与抗旱相关的相关性分析  50-51
  第三章结果与讨论  51-115
    1 结果  51-101
      1.1 32个拟南芥核心生态型的抗旱指标及综合抗旱性分析  51-60
        1.1.1 与抗旱相关的一些生理指标分析  51-56
          1.1.1.1 水分状况指标与抗旱性分析  51-53
          1.1.1.2 细胞膜透性与抗旱性分析  53-54
          1.1.1.3 光合水分利用效率与抗旱性分析  54-55
          1.1.1.4 ABA含量与抗旱性分析  55-56
        1.1.2 32个核心生态型抗旱指标的综合比较  56-60
          1.1.2.1 综合抗旱性的聚类分析  56-58
          1.1.2.2 抗旱指标的聚类分析  58-60
      1.2 CBF4基因的SNP发现及其与抗旱表型的相关性分析  60-73
        1.2.1 CBF4基因SNP多态性结果分析  60-66
        1.2.2 CBF4基因核苷酸变化与抗旱生理指标的相关性分析  66-73
          1.2.2.1 CBF4基因5′非编码区与抗旱生理指标及综合抗旱性的相关性  66-70
          1.2.2.2 CBF4蛋白氨基酸变化与抗旱生理指标及综合抗旱性的相关性  70-73
      1.3 ATHK1基因的SNP发现及其与抗旱表型的相关性分析  73-86
        1.3.1 ATHK1基因SNP多态性结果分析  73-79
        1.3.2 ATHK1基因核苷酸变化与抗旱生理指标的相关性分析  79-86
          1.3.2.1 ATHK1基因5′非编码区与抗旱生理指标及综合抗旱性的相关性  79-81
          1.3.2.2 ATHK1蛋白氨基酸变化与抗旱生理指标及综合抗旱性的相关  81-86
      1.4 NCED3基因的SNP发现及其与抗旱表型的相关性分析  86-101
        1.4.1 NCED3基因SNP多态性结果分析  86-92
        1.4.2 NCED3基因核苷酸变化与抗旱生理指标的相关性分析  92-101
          1.4.2.1 NCED3基因5′非编码区与抗旱生理指标及综合抗旱性的相关性  92-96
          1.4.2.2 NCED3蛋白氨基酸变化与抗旱生理指标及综合抗旱性的相关性  96-101
    2 讨论  101-115
  结论  115-116
  参考文献  116-122
  附录  122-142
第二部分 ATHK1基因参与调节拟南芥渗透胁迫信号转导过程  142-167
  第一章前言  143-144
  第二章材料和方法  144-153
    1 材料  144-145
    2 方法  145-153
  第三章结果和讨论  153-159
    1 结果  153-156
      1.1 PEG处理后的表型差异  153
      1.2 离体叶片失水率差异  153
      1.3 PEG胁迫前后的细胞膜离子渗透率差异  153-154
      1.4 PEG胁迫下ATHK1突变体和野生型基因表达的差异  154-156
    2 讨论  156-159
  结论  159-160
  参考文献  160-163
  附录  163-167
攻读学位期间发表的学术论文  167-168
致谢  168

拟南芥抗旱候选基因的SNP及其与抗旱性状的相关性分析以及ATHK1基因的功能研究

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