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抗多囊蛋白-1单克隆抗体和多克隆抗体的制备及其在常染色体显性遗传性多囊肾病发病机理研究中的应用

作　者: 赵海丹
导　师: 梅长林
学　校: 第二军医大学
专　业: 内科学
关键词: 常染色体显性遗传性多囊肾病多囊肾病1基因多囊蛋白-1 单克隆抗体多克隆抗体剪切
分类号: R692.1
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是人类最常见的致死性单基因遗传病之一，列遗传性肾病的第一位。其特征是双侧肾囊肿呈进行性发生并增大，疾病逐渐进展，常在患者中年后期即发展为终末期肾衰竭。这种囊性疾病危害甚大，不仅发生在肾脏，也常累及肾外器官，可引起多囊肝、颅内动脉瘤、心脏瓣膜异常等。 85～90％的ADPKD的发生系由于多囊肾病1基因(PKD1)的编码产物——多囊蛋白-1的结构和功能异常所致。在肾脏，多囊蛋白-1主要表达于肾小管上皮细胞，它是一个分子量约500kD的跨膜糖蛋白，由1个庞大的胞外区，11个跨膜区和1个相对小的胞浆尾组成。胞外区所拥有的众多复杂的蛋白基序决定了多囊蛋白-1的胞外部分对其行使正常的生理功能非常重要。我们制备的抗体选择针对多囊蛋白-1胞外区氨基端的部分LRR区和部分WSC区，并进一步研究验证多囊蛋白-1胞外区剪切理论的正确性，探讨体液中多囊蛋白-1的定量检测在临床ADPKD诊治中的应用价值。本研究由三部分组成。一、多囊蛋白-1胞外区的重组表达及纯化提取健康人肾组织总RNA，根据已知的PKD1cDNA序列(GenBank L33243)，自行设计2对引物跨越多囊蛋白-1成熟蛋白的氨基端部分LRR区和部分WSC区。用一步法RT-PCR选择扩增编码多囊蛋白-1这一多拷贝区的两个cDNA片段(其大小分别为502bp和471bp)，并将之克隆到融合蛋白表达载体pQE30中，构建的表达载体pQE30-PKD1e1和pQE30-PKD1e2，经限制性内切酶酶切和DNA测序证实为所需要的质粒多只矍堡木:社丝类竺竺主(’肾脏病学)一一一一一一一一一一一一一一一一一止匕左鱼里后，将其转染含有阻遏质粒pRE户4的大肠杆菌M，5。异丙基硫代半乳糖昔(lpTG)诱导表达氨基端有6个连续组氨酸的融合蛋白，用Ni一NTAAgarose行亲和层析纯化融合蛋白。纯化产物经聚丙烯酞胺凝胶电泳 (505一尸AGE)显示出相对分子质量分别为1 9.sko、1 8.gko的融合蛋白，经Western blot鉴定为多囊蛋白一，的融合蛋白。这2段多囊蛋白一，的氨基端序列都可用于免疫动物，制备抗多囊蛋白一1胞外区氨基端的抗体。二、抗多囊蛋白一1单克隆抗体和多克隆抗体的制备将纯化好的分子量，8.gko的多囊蛋白一，的融合蛋白皮下免疫BalblC小鼠和新西兰大白兔，分别制备抗多囊蛋白一1的单克隆抗体和多克隆抗体。制备多克隆抗体时，只需在兔血清多抗效价达到要求时(约免疫3个月后)取兔血清，再用亲和层析法行lgG纯化。单克隆抗体的制备过程简述如下:小鼠免疫成功后，取其脾脏细胞在聚乙二醇4000诱导下与骨髓瘤细胞株SPZ10进行细胞融合，日AT选择性培养筛选出融合细胞，用间接酶联免疫吸附试验(间接EUSA法)筛选出分泌抗多囊蛋白一1氨基端抗体的杂交瘤细胞，再以有限稀释法进行克隆化培养，得到稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株7B，，直接EUSA法测得该细胞株分泌的单克隆抗体亚型为lgG，型，Westem blof分析结果表明单克隆抗体(和多克隆抗体)均与多囊蛋白一，的胞外氨基端呈阳性反应。将该株7BI杂交瘤细胞接种于同系小鼠腹腔，诱导产生腹水，亲和层析法纯化小鼠腹水和兔血清中的lgG型抗体。间接EUSA法测定纯化后的抗体效价分别为:多克隆抗体1:1.5x105;单克隆抗体效价为1:lx104。三、多囊蛋白一，的组织细胞学定位和体液中多囊蛋白一，胞外段的定量检测，.多囊蛋白一1在肾组织和细胞中的表达研究多囊蛋白一，在组织、细胞及亚细胞水平的分布、定位为分析多囊蛋白一，的功能提供了第一线索。多囊蛋白一1在肾脏、大脑、肝脏、胰腺、心脏、小肠等许多组织中都有表达，但多囊蛋白一，的亚细胞定位仍有争议，可能是由于不同的单克隆抗体或多克隆抗体针对一个庞大蛋白的不同抗原决定第二军医人学博士学位论文(肾脏病学)中文摘要簇所致。在本实验中，我们用自制的尸KD，mRNA原位杂交探针和抗多囊蛋白一，胞外区氨基端抗体，用高敏感性和特异性的原位杂交方法和免疫组织化学方法研究多囊蛋白一1在不同肾组织和几种肾细胞株中的表达和分布，以期对多囊蛋白一1的肾组织学分布和细胞水平的精确定位有更深入的了解。结果发现，多囊蛋白一1在胎肾组织中主要表达于近端肾小管，定位于细胞的胞浆和胞膜;在正常成人肾组织中，多囊蛋白一1主要表达于远端肾小管和集合管;在成人AO户KO肾组织中，多囊蛋白一，广泛分布于囊肿衬里上皮细胞。在AO尸KO囊肿衬里上皮细胞株和猪近端肾小管细胞株 (LLC一pK，)中均检测到了多囊蛋白一，的表达，主要定位于细胞膜，在胞浆中也有少量表达。这些实验结果基本上同上文提及的国外近年文献报道的检测结果相一致。2.体液中多囊蛋白一，胞外段的定量检测 Qian等人最近提出多囊蛋白一1在G蛋白偶联受体的蛋白分解位点(多囊蛋白一，的GpS区)发生剪切，GpS区的蛋白分解剪切功能可能与多囊蛋白一1在肾脏中的正常功能有关。按照这种理论，多囊蛋白一，虽不是分泌蛋白，但在体液中应该能检测到多囊蛋白一1的胞外区部分，而且正常人

全文目录

缩略词表  4-5
中文摘要  5-9
英文摘要  9-13
前言  13-23
第一部分多囊蛋白-1胞外区的重组表达及纯化  23-46
  (一) 材料和方法  23-29
  (二) 结果  29-43
  (三) 讨论  43-46
第二部分抗多囊蛋白-1单克隆抗体和多克隆抗体的制备  46-66
  (一) 材料和方法  46-56
  (二) 结果  56-61
  (三) 讨论  61-66
第三部分多囊蛋白-1在组织和细胞中的表达研究及体液中多囊蛋白-1的定量检测  66-92
  (一) 材料和方法  66-75
  (二) 结果  75-84
  (三) 讨论  84-92
小结  92-94
参考文献  94-99
致谢  99-100
综述  100-135
在读期间发表的文章  135-136
附录1: 人PKD1 cDNA序列  136-144
附录2: 人多囊蛋白-1氨基酸序列  144-149

抗多囊蛋白-1单克隆抗体和多克隆抗体的制备及其在常染色体显性遗传性多囊肾病发病机理研究中的应用

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