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小鼠肝干细胞系的建立及其生物学特性研究

作　者: 李文林
导　师: 胡以平
学　校: 第二军医大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 肝干细胞卵圆细胞肝脏损伤
分类号: Q952
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

肝脏是哺乳类动物重要的消化器官，参与体内蛋白质、碳水化合物、脂类等生物大分子的代谢。肝脏的物质代谢功能决定了该器官容易受到不慎摄入的外界有害物质的损伤。很早就发现多种生物、理化因素引起肝脏损伤的同时，伴随有新生细胞的产生、增殖和分化，以修复损伤并维持肝脏功能的正常发挥。目前已有大量的实验证据表明，当广泛而慢性的损伤导致大量肝细胞死亡或者肝细胞的增殖能力被抑制时，在再生肝中可观察到卵圆细胞的增殖和分化。这种细胞并不存在于正常成体肝脏中，具有肝干细胞的特性，在适当的条件下能够分化为成熟肝细胞和胆管细胞。本课题致力于从损伤后的成体肝脏中分离并长期培养具有双向分化潜能的肝干细胞，并对其生物学特性进行研究。最近，Gordon GJ等报道了一种新的肝脏再生反应，他们首先用倒千里光碱(Retrorsine)抑制大鼠成熟肝细胞的再生能力，然后通过肝2/3切除施以肝脏强大的再生刺激。肝脏再生过程中，肝实质中会产生一种集落样增殖的“小肝细胞样原始细胞”(Small Hepatocyte-Like Progenitor Cells,SHPCs)，并通过这种细胞的增殖和分化完成肝脏的再生。本研究采用类似的方法损伤小鼠的肝脏，发现小鼠的肝再生反应与大鼠不同。在小鼠再生肝中并没有观察到从形态学上可以分辨的“小肝细胞样原始细胞”，但是有明显的胆管反应和卵圆细胞增殖。采用两步胶原酶消化法从损伤后的再生肝中分离细胞，经过长期的培养和不断的纯化，最终在体外建立了形态均一的连续细胞系。该细胞系是典型的上皮样细胞，体外生长时成“铺路石”样排布；在电镜下观察，细胞核质比大，胞浆中除一些线粒体和核糖体外缺乏其他细胞器；在体外培养时细胞可以保持不分化状态，表达卵圆／胆管细胞的分子标志，如CK14，CK19，OV6，OC．10，c-met等；还表达造血干细胞的分子标志，如Thy-1，c-kit，CD45等。这表明该细胞具有肝干细胞的分子表型，并因此将其命名为肝上皮样原始细胞(Liver Epithelial Progenitor Cells,LEPCs)。 DMSO和丁酸钠是两种最常用的小分子细胞分化诱导剂。在丁酸钠作用下，LEPCs的生长受到强烈抑制，细胞体积增大，核质比减小。诱导后第四天，有双核细胞产生。电镜下观察，胞浆中的细胞器较诱导前明显增多，有线粒体、内质网和高尔基体以及大量的核糖体和糖原颗粒。在细胞与细胞之间还观察到了肝细胞特征性的细胞间胆管结构。免疫细胞化学实验表明，诱导后的细胞表达成熟肝细胞功能性的分子标志，如白蛋白、Aldolase B、APO A4、李文林博士论文小鼠肝干细胞系的建立及其生物学特性研究APOB、AO日等。这有力的证明了在丁酸钠作用下，LEPCs可以被诱导分化为成熟肝细胞。胞外基质对细胞的生物学行为有着巨大的影响，Matrigel基质胶被广泛的应用于多种细胞类型的体外分化。将培养的LEPCs接种于铺有Matrigel基质胶的培养皿后，细胞很快聚集成团并向四周放射状生长出许多管状结构，在电镜下可观察到细胞团中包括胆管样结构。肝干细胞最本质的特征在于具有向成熟肝细胞和胆管上皮细胞分化的双向潜能。以上实验结果表明LE户Cs可以分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞，具有肝干细胞的特征。采用逆转录病毒介导的基因转染手段，将LEPCs标记LacZ、EGF户和OsREO作为报告基因。将标记后的细胞移植到小鼠损伤后的肝脏中研究了LEPCs在体内的分化走向。发现LEPCs可以在肝脏的微环境中分化为成熟的肝细胞并嵌和进入肝实质，在形态学上与临近的肝细胞不可区分。这进一步证明了LEpCs是一种来自小鼠损伤肝脏的肝干细胞系。同时也展示了肝干细胞在肝损伤性疾病治疗方面的潜在应用价值。我们首次从倒千里光碱损伤的小鼠肝脏中建立了肝干细胞系。目前，尚未见到从小鼠损伤肝脏中建立类似细胞系的报道。该细胞系已经在体外培养了一年以上，传代超过30代。细胞保持了正常的核型和增殖能力，裸鼠移植实验证明细胞不具有致瘤性。LE尸Cs的建立为研究肝脏的发育、肝脏损伤后的修复、肝脏肿瘤发生以及肝脏疾病的细胞治疗的重大生物学和医学问题提供了理想的细胞模型和材料。

全文目录

缩略词表  6-7
中文摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
前言  12-18
  一. 肝干细胞的存在  12-14
  二. 肝干细胞体外研究概况  14-16
  三. 本课题的研究背景、研究方法和目的  16-18
实验材料  18-25
  一、主要器材和设备  18-19
  二、主要试剂及其制备  19-24
  三、实验动物  24-25
实验方法  25-35
  一、小鼠倒千里光碱肝损伤模型的建立  25-26
  二、从损伤后的再生肝中分离培养LEPCs  26-28
  三、 LEPCs基本生物学特征的研究  28-29
  四、体外诱导LEPCs分化  29-31
  五、 LEPCs体外标记LacZ、EGFP、DsRED报告基因  31-32
  六、细胞和组织中报告基因的检测  32-33
  七、 LEPCs的体内移植  33-35
实验结果  35-53
  一、经倒千里光碱损伤、2／3切除后小鼠肝脏的再生反应  35-36
  二、 LEPCs细胞系的建立  36-37
  三、 LEPCs的基本生物学特性  37-42
  四、 LEPCs在体外具有分化为肝细胞和胆管细胞的双向潜能:  42-48
  五、 LacZ、EGFP和DsRED等报告基因的标记及在LEPCs中的表达  48-50
  六、 LEPCs在损伤后肝脏中的植入  50-53
讨论  53-64
  一. 小鼠的肝脏经倒千里光碱损伤、2／3切除后的再生反应与大鼠不同  53-54
  二. 建立LEPCs细胞系的要点  54-55
  三. LEPCs表达胆管／卵圆细胞和造血干细胞的分子标志  55-56
  四. LEPCs具有双向分化潜能  56-57
  五. LEPCs可以参与损伤肝脏的修复  57-59
  参考文献  59-64
综述: 肝干细胞研究进展  64-81
  一. 肝干细胞的存在  64-69
  二. 肝干细胞的分离培养和鉴定  69-73
  三. 肝干细胞的应用前景  73-75
  四. 参考文献  75-81
致谢  81-82
博士期间发表和形成的文章  82-83
附录: 逆转录病毒载体  83-84
  一. BAG载体图  83
  二. pLNCG C1载体图  83-84
  三. pLNCG DsRED载体图  84

小鼠肝干细胞系的建立及其生物学特性研究

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