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补骨合剂对大鼠骨髓基质细胞增殖、分化及凋亡的分子调控机理研究

作　者: 李楠
导　师: 王和鸣
学　校: 福建中医学院
专　业: 中医骨伤科学
关键词: 骨质疏松/中药疗法骨髓细胞/药物作用成骨细胞/药物作用细胞凋亡/药物作用转化生长因子β/药物作用 bcl-2/药物作用线粒体/药物作用膜电位/药物作用
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

目的：应用体外培养骨髓基质细胞，在细胞和分子水平观察补骨合剂对细胞增殖、分化和凋亡的影响，探讨补骨合剂治疗骨质疏松症的机理。方法：分离SD大鼠骨髓基质细胞，培养后应用MTT法测定补骨合剂对细胞增殖的影响；通过形态学、细胞超微结构观察、碱性磷酸酶、细胞内骨钙素、β转化生长因子1基因表达等指标，对骨髓基质细胞向成骨细胞转化的程度进行探讨；通过形态学、细胞超微结构、流式细胞术检测凋亡细胞周期和线粒体膜电位改变、bcl-2、bax蛋白基因表达等进行观察，对补骨合剂在细胞凋亡过程中的作用进行评价。结果：一定浓度的补骨合剂对体外培养骨髓基质细胞增殖有显著促进作用；可促进转化中的骨髓基质细胞分泌碱性磷酸酶和骨钙素，增强骨形态发生蛋白的活性，促进转化中的骨髓基质细胞表达β转化生长因子1，补骨合剂的这种促进骨髓基质细胞转化作用与密钙息基本相同。补骨合剂的早期应用可以使阻滞于G0／G1期的细胞减少，进入S期进行DNA合成的细胞增多，诱导凋亡的细胞在补骨合剂组bcl-2表达明显高于诱导组，而bax表达明显低于诱导组，且补骨合剂组线粒体的膜电位下降均非常显著低于诱导组。结论：补骨合剂治疗骨质疏松症的机理有三：其一，补骨合剂中可能含有直接刺激骨髓基质细胞增殖的成分，使其数量不断增加，进而使向成骨细胞分化的数量增加，从而促进骨形成；其二，补骨合剂可以增强重组人骨形态发生蛋白2的活性，促进转化中的骨髓基质细胞表达β转化生长因子1，大量分泌Ⅰ型胶原，以利于钙盐沉积。补骨合剂可以促进重组人骨形态发生蛋白2诱导的骨髓基质细胞分泌碱性磷酸酶和骨钙素，促进骨髓基质细胞向成骨细胞表型转化，从而促进钙、磷在骨表面沉积；其三，补骨合剂的早期应用可以使全反式维甲酸诱导的凋亡细胞減少，从而促进细胞有丝分裂，抑制细胞凋亡；对骨髓基质细胞线粒体膜上的bcl-2具有保护作用，同时通过阻止bax从胞浆中移至线粒体膜上而使bcl-2在与bax形成的同源二聚体中占据优势来阻止线粒体膜上的PT孔道开放，从而阻止线粒体释放凋亡诱导因子造成的线粒体膜电位改变和生物合成的破坏，达到抑制凋亡的目的。

全文目录

目录  2-5
中文摘要  5-6
英文摘要  6-8
前言  8-11
第一部分骨髓基质细胞的分离与培养  11-19
  1.1 研究目的  11
  1.2 实验材料  11-12
  1.3 实验方法与步骤  12-13
    1.3.1 MSC的分离与培养  12-13
    1.3.2 MSC的形态学观察  13
      1.3.2.1 苏木素染色  13
      1.3.2.2 倒置相差显微镜观察  13
      1.3.2.3 透射电子显微镜观察  13
    1.3.3 MSC生长曲线分析  13
  1.4 结果  13-15
    1.4.1 MSC的形态学观察结果  13-14
      1.4.1.1 苏木素染色观察结果  13
      1.4.1.2 倒置相差显微镜观察结果  13-14
      1.4.1.3 透射电子显微镜观察结果  14
    1.4.2 MSC生长曲线分析结果  14-15
  1.5 讨论  15-17
  1.6 小结  17-19
第二部分补骨合剂对体外培养MSC增殖的影响  19-24
  2.1 研究目的  19
  2.2 实验材料  19-20
  2.3 实验方法与步骤  20-21
    2.3.1 倒置显微镜观察  20
    2.3.2 MTT法检测补骨合剂对MSC增殖的影响  20
    2.3.3 MTT法检测rhBMP2的增殖作用  20-21
  2.4 结果  21-22
    2.4.1 倒置显微镜观察结果  21
    2.4.2 MTT法检测补骨合剂对MSC增殖的影响  21
    2.4.3 MTT法检测rhBMP2增殖作用结果  21-22
  2.5 讨论  22-23
  2.6 小结  23-24
第三部分补骨合剂对体外培养MSC分化的影响  24-38
  3.1 研究目的  24
  3.2 实验材料  24-25
  3.3 实验方法与步骤  25-29
    3.3.1 MSC的形态学观察  25-26
      3.3.1.1 倒置相差显微镜观察  25
      3.3.1.2 透射电子显微镜观察  25
      3.3.1.3 ALP染色Gomori钙钴法  25
      3.3.1.4 矿化结节染色von Kossa改良法  25-26
    3.3.2 ALP比活性测定  26
    3.3.3 细胞内骨钙素含量测定  26-27
    3.3.4 rhBMP2诱导MSC表达TGF-β1mRNA的测定  27-29
    3.3.5 补骨合剂促进rhBMP2诱导MSC表达TGF-β1mRNA的测定  29
  3.4 结果  29-32
    3.4.1 MSC的形态学观察结果  29-30
      3.4.1.1 倒置相差显微镜观察结果  29
      3.4.1.2 透射电子显微镜观察结果  29
      3.4.1.3 ALP染色Gomori钙钴法观察结果  29-30
      3.4.1.4 矿化结节染色von Kossa改良法观察结果  30
    3.4.2 ALP比活性测定结果  30
    3.4.3 细胞内骨钙素含量测定结果  30-31
    3.4.4 rhBMP2诱导MSC表达TGF-βmRNA的测定结果  31
    3.4.5 补骨合剂促进rhBMP2诱导MSC表达TGF-β1mRNA的测定结果  31-32
  3.5 讨论  32-36
  3.6 小结  36-38
第四部分全反式维甲酸对MSC凋亡的影响及补骨合剂的保护作用观察  38-52
  4.1 研究目的  38
  4.2 实验材料  38-40
  4.3 实验方法与步骤  40-43
    4.3.1 凋亡MSC的形态学观察  40-41
      4.3.1.1 荧光显微镜观察  40
      4.3.1.2 透射电子显微镜观察  40
      4.3.1.3 bax、bcl-2蛋白免疫组化染色  40-41
    4.3.2 流式细胞仪检测凋亡细胞周期变化  41-42
    4.3.3 流式细胞仪检测凋亡细胞线粒体跨膜电位改变  42
    4.3.4 凋亡细胞bax、bel-2mRNA表达检测  42-43
  4.4 结果  43-48
    4.4.1 凋亡细胞的形态学观察结果  43-44
      4.4.1.1 荧光显微镜观察结果  43-44
      4.4.1.2 透射电子显微镜观察结果  44
      4.4.1.3 bax、bcl-2蛋白免疫组化染色观察结果  44
    4.4.2 凋亡细胞周期变化流式细胞仪检测结果  44-45
    4.4.3 流式细胞仪检测凋亡细胞线粒体跨膜电位改变结果  45-46
    4.4.4 凋亡细胞bax、bcl-2mRNA表达检测结果  46-48
  4.5 讨论  48-51
  4.6 小结  51-52
结论  52-54
参考文献  54-58
致谢  58-59
附录  59-107
  附录1 附图  59-68
  附录2 综述骨髓基质细胞成骨作用研究进展  68-71
  附录3 在校期间发表论文目录  71-72
  附录4 在校期间发表论文(第一作者)  72-91
  附录5 在校期间获奖情况及中标课题  91-107
  附录6 个人简历  107

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