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血管内皮生长因子与慢性粒细胞白血病相关性的实验研究

作　者: 朱月永
导　师: 叶德富
学　校: 福建医科大学
专　业: 内科学
关键词: 血管内皮生长因子 寡核苷酸 反义 细胞凋亡 慢性髓性白血病
分类号: R733.72
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要


慢性粒细胞白血病（CML）是一种多潜能造血干细胞恶性克隆性疾病，特征性染色体易位形成的BCR/ABL融合基因为其分子基础。其治疗主要是化疗、IFNα及造血干细胞移植，但多数病人最终仍免不了复发、进入加速/急变期。研究表明CML骨髓微血管密度（MVD）明显高于正常骨髓，CML慢性期、急变期病人的MVD高于CML异基因骨髓移植后病人，提示血管新生在CML发病机制中起一定作用。探讨CML中血管内皮生长因子（VEGF）等血管新生调节因子表达的状态、及其在CML病程进展中的作用，有利于探索应用抗血管生成治疗CML的新途径。本研究包括以下四个方面：（1）CML患者骨髓和K562细胞VEGF及其受体的表达。采用RT-PCR方法检测CML骨髓细胞和K562细胞的VEGF、VEGFR-1（Flt-1）和VEGFR-2（KDR）mRNA的表达；免疫组化法检测K562细胞VEGF的蛋白表达；ELISA法检测K562、HL-60和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞的VEGF分泌状况。（2）VEGF对K562细胞的抗凋亡作用。通过形态学、DNA断裂琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪（FCM）DNA倍体分析观察VEGF对As2O3诱导的K562细胞凋亡的影响；利用蛋白印迹法（Western blotting）检测不同浓度的VEGF对K562细胞bcl-XL、Bax和caspase-3表达的影响；同时应用RT-PCR技术检测上述条件下bcl-XL、Bax和抗凋亡基因ZK7的mRNA变化。（3）VEGF对K562细胞Ang-2 mRNA及基质金属蛋白酶（MMP）-9表达的影响。分别应用RT-PCR、Western blotting检测不同浓度的VEGF对K562细胞Ang-2 mRNA表达的影响；VEGF不同浓度与不同作用时间下对K562细胞MMP-9的表达变化。（4）VEGF反义脱氧寡核苷酸（AS-ODN）抑制K562细胞生长的体外试验。合成一互补于人VEGF转录起始处第6—24位点、经硫代修饰的19 bp AS-PS-ODN，应用脂质体介导转入K562细胞，以正义寡核苷酸（S-PS-ODN）为对照，观察其对K562生长的影响；并应用RT-PCR、Western blotting检测不同浓度的AS-PS-ODN作用下K562细胞VEGF的mRNA和蛋白水平的改变，ELISA法检测其对K562细胞vEGF分泌的影响;利用FCM分析不同浓度的正、反义VEGF一PS一ODN对K562细胞P210蛋白表达、及对ASZO。诱导K562细胞凋亡的影响。结果发现:（1）恶性血液疾病细胞株K562、HL一60、U937、CA46与CML病人骨髓细胞VEGF和Flt一1 mRNA均阳性，K562与CML骨髓细胞还表达KDR mRNA;移植后患者的VEGF mRNA表达下调;K562细胞胞浆VEGF呈阳性表达;K562细胞培养的上清液中VEGF浓度明显高于HUVEC（P（0.01）。（2）在AsZO。作用下，DNA断裂琼脂糖凝胶电泳可见明显的梯状断裂小片断;FCM分析显示亚二倍体峰细胞数量增加，呈剂量依赖性;加入VEGF后K562细胞凋亡减少，但细胞周期分布无明显变化（P）0.05）。同时，随着VEGF浓度的增加，K562细胞bcl一XL的mRNA与蛋白表达水平上调，Bax的蛋白表达降低;阻止或减少激活pro一Caspase一3一CasPase一3。此外，VEGF还能上调抗凋亡基因ZK7的表达。（3） VEGF呈剂量依赖性上调K562细胞的Ang一2 mRNA表达、MMP一9的蛋白表达;调节MMP一9表达无明显的时间依赖性。（4）与VEGF的S一PS一ODN比较，AS一PS一ODN转染入K562细胞后，细胞的增殖速度明显减慢，且与AS一PS一ODN的剂量相关（P<0 .01）。AS一PS一ODN作用下，K562细胞的VEGFmRNA、蛋白的表达，及分泌均减少。同时，它还使K562细胞的P210蛋白的表达降低，使AsZO3诱导的细胞凋亡增加。得出以下结论:（1）CML骨髓细胞分泌VEGF的能力增强，VEGF在CML中存在过量表达，且存在着VEGF的自分泌环节。除细胞因子的旁分泌作用外，CML细胞还可以通过自分泌这一途径来维持自身的生长。（2） VEGF可抑制K562细胞的凋亡，这种能力可能是不依赖于细胞周期的改变。VEGF通过影响K562细胞的bel一XL/Bax表达的比率，调节着Caspase一3的活性，进而调节着细胞的程序性死亡—凋亡。vEGF在CML细胞中的抗凋亡作用也与上调ZK7基因的表达有关。（3） vEGF尚有通过上调Ang一2的表达及诱导产生MMP促进CML病情发展的作用。（4） VEGF AS一PS一ODN能有效抑制K562细胞的生长，下调K562细胞VEGF的mRNA及蛋白表达水平，减少其VEGF的分泌，从而促进细胞凋亡。 本研究揭示VEGF在CML发病机制中可能起一定作用，为应用以减少肿瘤细胞VEGF分泌为靶点的CML治疗新途径提供了实验依据。

全文目录


中文摘要  5-7
英文摘要  7-10
前言  10-13
第一部分 人慢性髓性白血病骨髓和K562细胞血管内皮生长因子及其受体的表达  13-25
  材料与方法  13-18
  结果  18-23
  讨论  23-25
第二部分 血管内皮生长因子对人慢性髓性白血病细胞系K562细胞的抗凋亡作用  25-38
  材料与方法  25-29
  结果  29-35
  讨论  35-38
第三部分 血管内皮生长因子对K562细胞Angiopoietin-2 mRNA及基质金属蛋白酶-9表达的影响  38-43
  材料与方法  38-39
  结果  39-41
  讨论  41-43
第四部分 血管内皮生长因子反义脱氧寡核苷酸抑制K562细胞生长的体外试验  43-54
  材料与方法  43-45
  结果  45-52
  讨论  52-54
结论  54-55
参考文献  55-60
综述 血管新生及其调控因子与恶性血液病  60-67
参考文献  67-71
致谢  71

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病 > 慢性白血病
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