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新疆家蚕抗菌肽结构与功能的关系及抗菌作用机理的研究

作　者: 刘忠渊
导　师: 王宾；张富春
学　校: 新疆大学
专　业: 动物学
关键词: 新疆家蚕抗菌肽 结构参数 基因修饰 结构与活性 雏鸡 生理生化指标 核酸免疫 抗体制备 紫外光谱 荧光光谱 免疫电镜 抗菌机理
分类号: Q51
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


本实验室已经从新疆家蚕克隆获得抗菌肽基因Cecropin-XJ,通过原核系统和真核系统表达获得了抗菌肽,并对抗菌肽的抗菌特性进行了研究。研究表明,新疆家蚕抗菌肽具有很强的热稳定性、能够杀灭氨苄青霉素抗性菌、对酸碱盐、人造胃酸有一定的耐受性,抗菌谱广,能够不同程度地杀灭革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。虽然已对新疆家蚕抗菌肽的特性进行了研究,但其结构与功能的关系及抗菌机理还没有完全揭示,本研究采用PCR扩增和人工合成基因的方法,对新疆家蚕抗菌肽基因进行修饰,进行体内抑菌实验与原核表达蛋白的抑菌活性研究,探讨其结构与活性的关系,同时研究了新疆家蚕抗菌肽对南宁麻花雏鸡促进生长及对血清激素水平、生理生化指标的影响:利用紫外光谱及以溴化乙锭为荧光探针的荧光光谱方法研究抗茵肽Cecropin-XJ与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)DNA在体外的相互作用,通过紫外分光光度法研究抗菌肽的抑菌动力学,并采用扫描电镜和透射电镜观察抗菌肽作用于金黄色葡萄球菌后的超微结构;通过核酸免疫法制备了鼠抗新疆家蚕抗菌肽的抗体,结合免疫胶体金技术和透射电镜技术观察抗菌肽在细菌体内的定位情况,探讨新疆家蚕抗菌肽的作用机理。主要研究结果如下:(1)抗菌肽的α-螺旋、两亲性、疏水性、净正电荷数、关键氨基酸的替换等参数是相互依赖、相互影响,协同发挥作用,任何一个参数的改变都会影响抗菌肽整体的活性。α-螺旋是抗菌肽功能有效性的结构基础,但其所处的位置并不影响抗菌活性;两亲性结构,是抗菌肽与生物膜相互作用的重要结构;疏水性程度必须保持在一定的范围内;在一定范围内增加抗菌肽的阳离子能够增加抗菌活性,但正电荷数和抗菌活性之间无绝对正相关性;色氨酸的存在及抗菌肽的C-末端酰胺化有利于增强抗菌肽的抗菌活性。(2)与对照组相比,1.5、3.5 mL/L添加抗菌肽的试验组雏鸡增重效果显著(P＜0.05),试验组血清总蛋白浓度差异不显著(P＞0.05),尿素氮水平下降显著(P＜0.05),血清胰岛素样生长因子-1(IGF-1)水平显著升高(P＜0.05)。在28日龄,试验组的三碘甲状腺原氨酸(T3)浓度高于对照组,差异不显著(P＞0.05),甲状腺素(T4)水平下降显著(P＜0.05);在56日龄,试验组的T3水平显著降低(P＜0.05),但T4水平高于对照组,差异显著(P＜0.05)。(3)真核表达载体pcDNA3/Cecropin-XJ和peDNA3/Ceeropin-XJ4R在小鼠肝脏内能获得有效表达。所制备的鼠抗新疆家蚕抗菌肽的抗血清具有较高的免疫反应性和特异性;实验组血清抗体水平显著高于对照组(P＜0.05),pcDNA3/Cecropin-XJ4R组的抗体水平高于pcDNA3/Cecropin-XJ组,但差异不显著。(4)利用紫外光谱及以溴化乙锭为荧光探针的荧光光谱方法研究抗菌肽Cecropin-XJ与金黄色葡萄球菌DNA在体外的相互作用,计算获得抗菌肽与DNA的结合常数和成键位点数。结果显示,抗菌肽使DNA发生了明显的增色效应,并使DNA的荧光强度增强,抗菌肽能与EB竞争性的结合DNA,表明抗菌肽可能与DNA双螺旋的沟槽结合;在抗菌肽存在下,DNA与EB作用的结合常数和成键位点数都发生变化,表明抗菌肽以嵌入和非嵌入两种方式与DNA相互作用。(5)通过紫外分光光度法研究抗菌肽的抑菌动力学,并采用扫描电镜和透射电镜观察抗菌肽作用于金黄色葡萄球菌后的超微结构,对抗菌肽作用机理进行初步探讨。结果表明,抗菌肽抑菌作用比较明显,抗菌肽的活性与作用时间有关。抗菌肽可能是通过“桶-板”模式渗透细胞膜,从而影响细胞膜的结构和功能,使细胞膜形成许多孔道,增强了金黄色葡萄球菌细胞的通透性,造成细胞内的原生质扩散,并从孔道向胞外渗漏,影响了细菌的代谢系统,从而起到抑菌、杀菌作用。抗菌肽使金黄色葡萄球菌细胞内容物大量渗漏而死亡,死亡细胞的细胞壁保持完整,表明细胞膜是抗菌肽作用的主要靶位点。(6)新疆家蚕抗菌肽处理金黄色葡萄球菌不同时间后,分别用抗菌肽抗体和胶体金标记的二抗处理,透射电镜观察的结果表明,抗菌肽的抗菌作用与浓度和时间相关,并定位于细胞膜和细胞质中。这些研究结果为进一步改造新疆家蚕抗菌肽,获得抗菌活性更高的抗菌肽,提供了科学依据,通过对Cecropin-XJ作用于S.aureus的机理探讨,提出了Cecropin-XJ以渗透细胞膜和与DNA结合两种作用机理抑杀金黄色葡萄球菌,对于丰富和理解cecropins的作用机制做出了一定的贡献。本研究为研发抗菌肽成为新一代替代抗生素的抗菌药物,尤其是针对抗生素抗性菌的药物提供了依据,为新疆家蚕抗菌肽在新疆畜牧业生产中的应用奠定了理论基础。

全文目录


中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-14
第一部 分文献综述  14-56
  第1章 抗菌肽结构与功能关系的研究  14-33
    1 抗菌肽的理化性质  14-15
    2 抗菌肽的分类  15-18
      2.1 α-螺旋型抗菌肽  15-16
      2.2 β-折叠型抗菌肽  16
      2.3 具环状结构的抗菌肽  16-17
      2.4 伸展性结构的抗菌肽  17-18
    3 影响抗菌肽活性的结构参数  18-23
      3.1 构象  18-19
      3.2 电荷  19-21
      3.3 两亲性和疏水力矩  21
      3.4 疏水性  21-22
      3.5 极角  22-23
    4 抗菌肽的结构改造  23-25
      4.1 残基替换  23-24
      4.2 杂合肽  24
      4.3 截取天然抗菌肽的部分序列  24
      4.4 增加正电荷含量  24-25
    5 展望  25-26
    参考文献  26-33
  第2章 抗菌肽抗菌作用机理的研究进展  33-46
    1 抗菌肽的抗菌作用  33-34
    2 抗菌肽抗细菌的作用机理  34-40
      2.1 抗菌肽与细菌细胞壁的作用  34
      2.2 抗菌肽与细菌细胞膜的作用  34-37
      2.3 抗菌肽与细菌胞质内靶目标的作用  37-40
    3 展望  40
    参考文献  40-46
  第3章 小分子多肽抗体的研究进展  46-56
    1 小分子多肽与载体偶联和使用免疫佐剂  46-47
    2 融合表达小分子多肽  47-49
    3 小分子多肽基因的核酸免疫  49-50
    4 核酸与蛋白/菌液联合免疫  50-51
    5 在小分子多肽中引入多抗原肽结构  51-52
    6 展望  52
    参考文献  52-56
第二部分 新疆家蚕抗菌肽结构与功能的研究  56-101
  第1章 新疆家蚕抗菌肽基因修饰及结构与活性关系研究  57-91
    1 材料和方法  59-64
      1.1 材料与试剂  59
      1.2 常规溶液  59-60
      1.3 引物设计与基因合成  60-61
      1.4 修饰基因的克隆  61-63
      1.5 序列分析  63
      1.6 推导的蛋白质二级结构预测分析  63
      1.7 原核表达载体的构建  63
      1.8 融合蛋白的表达、SDS-PAGE检测及纯化  63
      1.9 表达产物的抑菌活性检测  63-64
      1.10 表达产物的最小抑菌浓度(MIC)的测定  64
      1.11 表达产物的体内抑菌实验  64
    2 结果  64-80
      2.1 修饰基因的PCR扩增  64
      2.2 修饰抗菌肽基因cDNA片段推导的氨基酸序列及两亲性分析  64-68
      2.3 推导的蛋白质二级结构预测分析  68-70
      2.4 原核表达载体的构建  70-71
      2.5 融合蛋白的表达及纯化  71-73
      2.6 表达产物的抑菌活性检测  73
      2.7 表达产物的定量及最小抑菌浓度(MIC)  73-74
      2.8 表达产物的体内抑菌实验  74-80
    3 讨论  80-86
      3.1 抗菌肽修饰体的α-螺旋结构  81-82
      3.2 抗菌肽修饰体的两亲性分析  82-84
      3.3 抗菌肽修饰体的疏水性分析  84
      3.4 抗菌肽修饰体的电荷数分析  84-85
      3.5 抗菌肽修饰体中关键残基替换的分析  85-86
    4 展望  86-87
    参考文献  87-91
  第2章 新疆家蚕抗菌肽对雏鸡的促生长及血清激素、理化指标的影响  91-101
    1 材料与方法  93-94
      1.1 试验材料  93
      1.2 试验分组  93
      1.3 饲养管理  93
      1.4 测定指标及方法  93-94
      1.5 数据统计处理  94
    2 结果与分析  94-97
      2.1 不同阶段雏鸡增重  94-95
      2.2 雏鸡日耗料量和料重比  95
      2.3 总蛋白、尿素氮水平  95-96
      2.4 血清T3水平  96
      2.5 血清T4水平  96-97
      2.6 血清IGF-1水平  97
    3 讨论  97-99
    4 结论  99
    参考文献  99-101
第三部分 新疆家蚕抗菌肽抗菌作用机理的研究  101-160
  第1章 核酸免疫法制备新疆家蚕抗菌肽抗体  103-119
    1 材料与方法  105-108
      1.1 材料和试剂  105
      1.2 推导的蛋白质抗原表位预测分析  105
      1.3 重组表达载体的构建  105-106
      1.4 重组真核表达质粒和空载pcDNA3的大量制备及纯化  106
      1.5 Cecropin-XJ的原核表达  106
      1.6 重组质粒在小鼠肝脏中的瞬时表达  106
      1.7 重组蛋白抗血清的制备  106-107
      1.8 免疫血清中特异性抗体的ELISA检测  107-108
      1.9 统计分析  108
    2 结果与分析  108-114
      2.1 推导的蛋白质抗原表位预测分析结果  108-109
      2.2 重组表达载体的构建  109-110
      2.3 Cecropin-M2基因的原核表达  110-111
      2.4 重组质粒在真核细胞中表达的RT-PCR检测  111-112
      2.5 免疫血清中特异性抗体的ELISA检测结果  112-114
    3 讨论  114-117
    参考文献  117-119
  第2章 新疆家蚕抗菌肽与细菌DNA相互作用的光谱研究  119-134
    1 材料与方法  121-123
      1.1 试剂与仪器  121
      1.2 金黄色葡萄球菌染色体DNA的提取  121-122
      1.3 抗菌肽Cecropin-XJ的纯化  122
      1.4 凝胶阻滞实验  122-123
      1.5 紫外光谱法检测抗菌肽Cecropin-XJ与金黄色葡萄球菌DNA的相互作用  123
      1.6 荧光光谱法检测抗菌肽Cecropin-XJ与金黄色葡萄球菌DNA的相互作用  123
      1.7 抗菌肽Cecropin-XJ对EB—DNA复合体系滴定的荧光光谱  123
      1.8 EB对复合体系Cecropin-XJ—DNA滴定的荧光光谱  123
    2 结果与讨论  123-131
      2.1 抗菌肽的纯化结果  123-125
      2.2 凝胶阻滞实验结果  125-126
      2.3 抗菌肽Cecropin-XJ与金黄色葡萄球菌DNA相互作用的紫外光谱  126-127
      2.4 抗菌肽Cecropin-XJ与金黄色葡萄球菌DNA结合的荧光光谱  127-128
      2.5 抗菌肽Cecropin-XJ对EB—DNA复合体系滴定的荧光光谱结果  128-129
      2.6 EB对复合体系Cecropin-XJ—DNA滴定的荧光光谱  129-130
      2.7 抗菌肽Cecropin-XJ与金黄色葡萄球菌DNA的结合方式与Scatchard方程  130-131
      2.8 抗菌肽Cecropin-XJ与DNA的作用模式  131
    3 结论  131-132
    参考文献  132-134
  第3章 新疆家蚕抗菌肽抗菌作用的超微结构观察  134-146
    1 材料和方法  135-137
      1.1 新疆家蚕抗菌肽  135
      1.2 仪器  135-136
      1.3 受体菌和试剂  136
      1.4 抗菌肽抑菌活性检测  136
      1.5 抗菌肽对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响  136
      1.6 抗菌肽对金黄色葡萄球菌细胞通透性的影响  136
      1.7 扫描电镜观察抗菌肽对金黄色葡萄球菌的影响  136-137
      1.8 透射电镜观察抗菌肽对金黄色葡萄球菌影响的超微结构  137
    2 结果  137-142
      2.1 抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌活性  137
      2.2 抗菌肽对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响  137-138
      2.3 抗菌肽对金黄色葡萄球菌细胞通透性的影响  138-139
      2.4 扫描电镜观察抗菌肽对金黄色葡萄球菌影响的结果  139-140
      2.5 透射电镜观察抗菌肽对金黄色葡萄球菌影响的超微结构  140-142
    3 讨论  142-144
    参考文献  144-146
  第4章 免疫胶体金法研究抗菌肽在金黄色葡萄球菌细胞中定位  146-160
    1 材料和方法  147-149
      1.1 受体菌和试剂  147-148
      1.2 用于检测的新疆家蚕抗菌肽  148
      1.3 仪器  148
      1.4 抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)检测  148
      1.5 抗菌肽对金黄色葡萄球菌抑菌动力学  148
      1.6 金黄色葡萄球菌样品的抗菌肽处理  148
      1.7 超薄切片的制备  148-149
      1.8 免疫胶体金标记及染色  149
    2 结果  149-152
      2.1 抗菌肽的最小抑菌浓度和抑菌动力学  149-150
      2.2 免疫电镜观察结果  150-152
    3 讨论  152-156
      3.1 在抗菌肽处理下金黄色葡萄球菌的细胞壁与质壁分离  152-154
      3.2 抗菌肽进入细胞内  154-155
      3.3 抗菌肽与细胞质膜相互作用  155-156
    参考文献  156-160
第四部分 结论与展望  160-162
附录1 英文缩略语  162-163
附录2 主要实验仪器  163-165
致谢  165-166
个人简介  166-167
攻读博士学位期间发表学术论文  167-168

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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