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靶向AR基因的RNA干扰诱导膀胱癌T24细胞凋亡的实验研究

作　者: 何围
导　师: 齐琳
学　校: 中南大学
专　业: 外科学
关键词: 膀胱移行细胞癌双氢睾酮雄激素受体 RNA干扰慢病毒载体丝裂霉素C 凋亡
分类号: R737.14
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景和目的多年来关于膀胱癌的一个问题一直存在——为什么男性患者大约是女性患者的3倍之多?长期以来认为这要归因于男性的高吸烟率和高风险的工作,但是随着各行各业女性工作者和女性烟民数量的大量增加,这一差距并没有改变。性激素在致癌过程中的作用日益引起人们的关注。最初对性激素的研究均注重于性激素的靶器官,如乳腺、卵巢、前列腺等。1984年Ahmed证实在肾癌组织中存在雄激素受体(Androgen Receptor, AR)、雌激素受体(Estrogen Receptor, ER)和孕激素受体(Progesterone Receptor, PR),泌尿系肿瘤与性激素间的关系令人瞩目。膀胱癌是泌尿系最常见的肿瘤,也是性别差异较大的肿瘤之一。随着在膀胱癌组织中相继发现了AR, ER和PR,有人认为性激素通过其受体在膀胱癌的发生、发展过程中有一定作用。AR在人体组织分布很广泛,除了在前列腺、精囊等生殖器官外,在中枢神经系统、骨骼肌以及肾脏、肝脏组织中都存在AR。在人类的肿瘤中,前列腺癌、肝癌、大肠癌、黑色素瘤中都有AR。在膀胱癌组织中也有AR,李世文等检测64例膀胱移行细胞癌,AR阳性率为78.13%,高于17例正常膀胱粘膜AR阳性率41.18%；在64例膀胱癌中,8例Ⅰ级膀胱癌AR阳性率100%,27例Ⅱ级癌AR阳性率81.48%,29Ⅲ-Ⅳ级癌AR阳性率68.97%,提示膀胱癌AR阳性率随肿瘤分级增加而降低。同时还发现同一患者的癌组织AR阳性率高于癌旁组织及自身膀胱粘膜,原发肿瘤的AR阳性率高于复发肿瘤,程荣璇等检测93例膀胱移行细胞癌,AR阳性率为52.68%,AR阳性患者中多发性癌较高,非浸润性癌的AR阳性率高于浸润性癌,分化好的AR阳性率高于分化差的,并认为AR可能是膀胱癌新的生物学标记,检测AR对预测膀胱癌预后有重要意义。化疗药物灌注膀胱诱导癌细胞凋亡已成为膀胱癌术后辅助治疗的主要手段。然而临床结果显示灌注后仍有较高的复发率。其主要原因就是对化疗药物耐药及敏感性下降,导致细胞凋亡不足。有大量资料显示,在许多肿瘤细胞的凋亡中发现有Caspase的活化。在此传导途径中起关键作用的caspase-3在许多正常组织和肿瘤组织中表达,而且许多肿瘤治疗是通过caspase-3途径介导的。caspase-3表达下调导致膀胱癌细胞凋亡减少,可能在膀胱癌的发生发展过程中起重要作用。RNA干扰(RNA interference, RNAi)作为一种高效的基因沉默技术,有望成为基因治疗的有效手段。通过RNAi实现对AR的沉默,能够分析其在肿瘤中的作用：雄激素是否通过AR促进了膀胱癌细胞的增殖能力?AR与细胞周期调节和信号转导之间的关系如何?其机制可能是什么?圆满地解决这些问题,必然将找到预防和治疗膀胱癌的新途径,延长膀胱癌患者的生命,具有潜在的经济与社会效益。正是在这样的前提与背景下,本研究拟准备：①研究雄激素对膀胱癌细胞株T24的生长的影响,其与AR表达之间的关系；②构建靶向于AR的慢病毒载体；③探讨AR在丝裂霉素C诱导膀胱癌T24细胞系凋亡中所发挥的作用及其与凋亡信号通路的联系,从而为抑制膀胱癌细胞增殖治疗和加强化疗药物对膀胱癌细胞的作用效果提供实验依据。目的探讨DHT对膀胱癌细胞株T24及其AR表达的作用。方法采用细胞培养和RT-PCR方法研究不同的DHT浓度(0、10-10M、10-9M、10-8M)对膀胱癌细胞株(T24)中ARmRNA的表达；MTT法测细胞生长曲线,观察其对细胞增殖的影响。结果Real-time PCR扩增良好。溶解曲线图中没有出现杂峰,也未出现主峰的异常增宽,表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。分析数据提示不同DHT浓度对AR表达无明显影响(P>0.05)。而在不同水平DHT培养T24细胞第4天和第5天MTT检测结果分析显示光吸收值无显著性差异(P>0.1)。小结T24细胞表达AR；DHT浓度对AR表达无明显影响；DHT对T24细胞无直接刺激增殖作用。目的制备靶向于AR的干扰慢病毒载体,为进一步研究AR提供条件。方法针对AR基因靶基因序列,利用公用网站按照RNA干扰序列设计原则,设计2个RNA干扰靶点序列,使用双链DNA oligo,,其两端含酶切位点粘端,直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的感受态细胞,对长出的克隆先进行PCR鉴定,在进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。通过RT-PCR检测两种慢病毒载体感染T24细胞后,AR基因的表达情况。结果通过阳性克隆测序,证实两条序列构造载体分别成功。慢病毒滴度测定两个病毒载体滴度分别为1E+9,2E+9 TU/mL。从荧光观察结果可见：T24细胞的感染效率都达到80%以上。T24细胞中,KD1,KD2组对AR基因的表达有显著敲减效果。相对NC组,KD1,KD2组对AR基因敲减效率分别达到85%以上(P<0.05)。小结利用RNAi的理论和方法制备出2个靶向AR基因的慢病毒载体。目的探讨AR在丝裂霉素诱导膀胱癌T24细胞系凋亡中所发挥的作用,从而为抑制膀胱癌细胞增殖治疗和加强化疗药物对膀胱癌细胞的作用效果提供实验依据。方法采用RNAi及MTT和流式细胞术(FCM)等方法观察AR对丝裂霉素C诱导T24细胞凋亡的影响。Realtime RT-PCR技术检测T24细胞中ARmRNA和caspase3mRNA的表达。结果分别于转染后RT-PCR检测AR及caspase3的表达,ARmRNA显著降低(P<0.05),而caspase-3显著增高(P<0.05)。流式细胞仪检测空白组、阴性对照组及转染组MMC作用的凋亡率结果,在不加化疗药物的情况下,单纯转染RNA干扰载体,细胞的凋亡率与转染前相比稍有升高,在MMC的作用下,抑制AR的表达后,细胞的凋亡率可明显升高,转染组细胞凋亡率为(35.38±1.54)%,明显高于空白组(15.67±1.23)%与阴性对照组(17.43±1.45)%,差异有统计学意义(P<0.05)。小结AR-siRNA介导膀胱癌T24细胞系凋亡可能通过caspase途径。AR明显抑制了丝裂霉素(MMC)诱导膀胱癌T24细胞的凋亡,高表达AR可能是膀胱癌易复发和产生多药耐药的一个重要原因。

全文目录

中文摘要  3-8
英文摘要  8-14
英文缩略词  14-15
第一部分不同水平DHT对膀胱癌细胞株T24生长及其AR表达的影响  15-26
  1. 材料和方法  15-19
  2. 结果  19-23
  3. 讨论  23-25
  4. 小结  25-26
第二部分 AR基因RNA干扰慢病毒载体制备  26-45
  1. 材料和方法  26-36
  2. 结果  36-42
  3. 讨论  42-44
  4. 小结  44-45
第三部分 AR影响丝裂霉素诱导膀胱癌T24细胞系凋亡及其机制研究  45-51
  1. 材料和方法  45-46
  2. 结果  46-48
  3. 讨论  48-50
  4. 小结  50-51
结论  51-52
参考文献  52-63
综述一  63-78
综述二  78-91
致谢  91-92
攻读学位期间主要的研究成果  92

靶向AR基因的RNA干扰诱导膀胱癌T24细胞凋亡的实验研究

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