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间充质干细胞对哮喘小鼠CD4~+CD25~+调节性T细胞和气道炎症的影响

作　者: 李建国
导　师: 冉丕鑫
学　校: 广州医学院
专　业: 呼吸内科学
关键词: 骨髓 间充质干细胞 小鼠 细胞培养 调节性T细胞 哮喘 免疫调节 肺/病理学 抗CD25~+单克隆抗体
分类号: R562.25
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


支气管哮喘(简称)的本质是变态反应性气道慢性炎症。然而,在哮喘的免疫发病机制中,经典的Th1/Th2失衡理论很难解释哮喘免疫调节失常的全过程,还存在其他免疫学机制参与调节哮喘气道炎症的形成。最近研究发现调节性T细胞(Regulatory T cells, Treg)是CD4+T淋巴细胞的一个亚群,能积极的控制或抑制其他细胞的功能,抑制免疫反应,从而对机体免疫系统产生重要的调节作用。支气管哮喘是气道慢性炎症性疾患,同时也是外周免疫耐受机制发生缺陷的疾病。越来越多的证据表明,Treg与哮喘变态反应性炎症和维持机体自身免疫耐受有着密切的关系。CD4+CD25+Treg由Sakaguchi等首先描述,是天然存在的Treg,又称胸腺源性Treg,是调节性T细胞的主要组成成分,在哮喘的免疫学发病中起着重要的作用。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells ,MSCs)是骨髓中造血干细胞外的另一类具有高度可塑性的细胞群体,在特定的诱导条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、肌细胞、神经细胞、脂肪细胞等间质细胞分化的能力,具有广泛的临床应用前景。近年的研究表明,MSCs除具有多向分化潜能外,还具有免疫调节作用。骨髓MSCs可上调CD4+CD25+Treg比例,抑制混合淋巴细胞反应(MLR)中或丝裂原(PHA)刺激引起的T淋巴细胞的增殖。MSCs不表达主要组织相容性复合体II类分子(MHC-II)、Fas配体和T细胞共刺激分子B7-1、B7-2、CD40、CD40L,MSCs不易被宿主免疫细胞识别,并能逃避免疫系统的免疫排斥。异基因MSCs不但可以进入受体的免疫器官,而且可在体内较长期存在。因此,MSCs用于细胞治疗具有独特的优势,但MSCs能否上调哮喘小鼠CD4+CD25+Treg,改善哮喘小鼠气道炎症,具有治疗哮喘的潜在临床应用前景,目前尚未见报道。我们将体外扩增的MSCs植入哮喘小鼠体内,观察MSCs对哮喘小鼠外周血CD4+CD25+Treg及气道炎症的影响,然后采用大鼠抗小鼠CD25+单克隆抗体去除哮喘小鼠外周血CD4+CD25+ Treg,观察哮喘小鼠去除CD4+CD25+Treg后气道炎症的变化以及骨髓间充质干细胞对去除CD4+CD25+ Treg哮喘小鼠气道炎症的影响,探讨MSCs减轻哮喘小鼠气道炎症的可能机制。本研究包括三个部分:第一部分小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定第二部分间充质干细胞上调哮喘小鼠外周血CD4+CD25+调节性T细胞减轻气道炎症第三部分间充质干细胞对去除CD4+CD25+调节性T细胞哮喘小鼠气道炎症的影响一、小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定目的:建立一种从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞(mMSCs)的高效方法,并在体外进行传代扩增和鉴定。方法:采取贴壁筛选法分离和纯化小鼠骨髓间充质干细胞(mMSCs),检测mMSCs在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞分化能力,用流式细胞术及显微镜分别检测mMSCs纯度和形态特征。结果:mMSCs贴壁生长后形态较均一,细胞形态呈成纤维细胞样,流式细胞术检测:CD45,CD11b,CD44及CD29分别为3.34%,2.41%,98.46%,99.36%。第四代mMSCs经诱导后可向成骨细胞和脂肪细胞分化。结论:贴壁筛选法分离小鼠骨髓MSCs效率和纯度高,稳定性好。分离培养的细胞其形态、流式细胞术检测的表面标记和多向分化潜能符合MSCs的特征。成功分离、培养、扩增小鼠骨髓MSCs为进一步动物实验奠定了基础。二、间充质干细胞上调哮喘小鼠外周血CD4+CD25+调节性T细胞减轻气道炎症目的:探讨同种异体骨髓间充质干细胞(MSCs)对哮喘小鼠外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)及气道炎症的影响。方法:将健康6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠30只随机分为3组,每组10只,分别为正常对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、MSCs处理组(C组),B组和C组以500μg/ml卵白蛋白(OVA)溶液0.2ml腹腔注射致敏,以5%OVA溶液雾化吸入激发建立小鼠哮喘模型,A组以等量生理盐水代替OVA,C组在诱导哮喘的第10天经尾静脉注入小鼠骨髓MSCs,流式细胞术检测小鼠外周血CD4+CD25+Treg占淋巴细胞的比例,并检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞计数,结合病理切片分析气道炎症情况。结果:A组、B组、C组小鼠外周血CD4+CD25+Treg占淋巴细胞比例分别为(5.81±0.76)%、(3.21±0.74)%、(5.12±0.34)%,A组和B组比较差异有统计学意义(P<0.01),B组和C组比较差异有统计学意义(P<0.01);A组小鼠BALF中炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞计数分别为(5.93±1.86)×104/ml、(0.06±0.04)×104/ml,B组小鼠BALF中炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞计数分别为(51.15±7.42)×104/ml、(14.24±2.84)×104/ml,C组小鼠BALF中炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞分别为(24.87±3.15)×104/ml、(4.34±0.44)×104/ml,A组和B组比较差异有统计学意义(P<0.01),B组和C组比较差异有统计学意义(P<0.01);病理切片显微镜下观察,A组小鼠气道无明显炎症改变,B组小鼠支气管、血管粘膜下和周围肺组织有明显炎症细胞浸润、气道上皮增生、气道黏液增多、气道上皮部分断裂脱落,C组小鼠气道炎症明显减轻。结论:静脉输注小鼠骨髓MSCs能上调哮喘小鼠外周血CD4+CD25+Treg比例,同时对哮喘小鼠气道炎症有显著抑制作用。上调CD4+CD25+Treg可能是MSCs抑制哮喘小鼠气道炎症的作用机制。三、间充质干细胞对去除CD4+CD25+调节性T细胞哮喘小鼠气道炎症的影响目的:观察小鼠骨髓间充质干细胞对去除CD4+CD25+Treg哮喘小鼠气道炎症的影响,探讨MSCs上调CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)在改善哮喘小鼠气道炎症中的作用。方法:将健康六周龄SPF级雌性BALB/c小鼠40只,随机分为5组,每组8只,分别为正常对照组(A组),哮喘模型组(B组),去除Treg细胞哮喘模型组(C组),MSCs处理组(D组),去除Treg细胞MSCs处理组(E组), B组﹑C组﹑D组和E组以500μg/ml卵白蛋白(OVA)溶液0.2ml腹腔注射致敏,以5%OVA溶液雾化吸入激发建立小鼠哮喘模型,A组以生理盐水代替OVA,C组和E组小鼠在激发前1天尾静脉注射0.25mg大鼠抗小鼠CD25+单克隆抗体,并在激发试验第三天强化注射0.25mg大鼠抗小鼠CD25+单克隆抗体,维持Treg细胞低水平。D组与E组在诱导哮喘的第10天经尾静脉注入0.2ml浓度调整为1×106/ml的MSCs,其余三组经尾静脉注入等量PBS。流式细胞术检测外周血CD4+CD25+Treg占淋巴细胞的比例,检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞计数,结合病理切片分析气道炎症情况。结果:A组、B组、C组、D组、E组小鼠小鼠外周血CD4+CD25+Treg占淋巴细胞比例分别为(5.86±0.48)%、(3.60±0.41)%、(0.32±0.11)%、(4.72±0.22)%、(0.33±0.11)%,A组和B组比较差异有统计学意义(P<0.01),B组和C组比较差异有统计学意义(P<0.01);A组BALF炎症细胞总数及Eos分别为(4.93±1.68)×104 /ml、(0.03±0.01)×104 /ml ,B组为(62.84±9.67)×104 /ml、(18.93±3.40)×104 /ml,C组为(80.59±11.34)×104 /ml、(29.26±5.43)×104 /ml,D组为(27.68±4.92)×104 /ml、(4.87±0.55)×104 /ml,E组为(29.59±6.67)×104 /ml、(5.51±1.75)×104 /ml,A组BALF炎症细胞总数及Eos计数与其它四组相比有统计学意义(P<0.01)。B组﹑C组﹑D组和E组BALF炎症细胞总数及Eos计数组间比较有统计学意义(P<0.01);光镜下小鼠气道炎症程度评分正常对照组0 (0~1)分,B组3(2~4)分,C组4 (3~4)分,D组2(1~3)分,E组2 (1~3)分,组间比较有统计学意义(H=32.527,P<0.01),A组小鼠与其它4组比较,炎症改变有显著差别(P<0.01);D组﹑ E组气道炎症改变较B组和C组有所减轻, C组较B组炎症改变有所加重(P<0.05),D组和E组炎症改变无显著差别(P>0.05)。结论:和未去除外周血CD4+CD25+Treg的哮喘小鼠相比,哮喘小鼠去除外周血CD4+CD25+Treg其气道炎症显著加重,静脉输注MSCs能上调哮喘小鼠外周血CD4+CD25+Treg比例,对哮喘小鼠气道炎症具有显著的抑制作用。去除外周血CD4+CD25+Treg的哮喘小鼠静脉输注MSCs,其气道炎症仍呈现明显抑制作用,与未去除外周血CD4+CD25+Treg哮喘小鼠相比,MSCs对去除外周血CD4+CD25+Treg哮喘小鼠气道炎症的抑制作用有所减弱,但与未去除外周血CD4+CD25+Treg哮喘小鼠相比并无显著性差异。结果进一步表明外周血CD4+CD25+Treg比例下降参与了哮喘小鼠气道炎症的形成,MSCs上调外周血CD4+CD25+Treg比例仅仅是其抑制哮喘小鼠气道炎症的机制之一,MSCs对哮喘小鼠气道炎症的影响还存在其他重要机制。

全文目录


中英文对照词汇表  5-6
摘要  6-11
ABSTRACT  11-16
前言  16-20
第一部分 小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定  20-30
  材料和方法  20-24
  结果  24-25
  讨论  25-27
  参考文献  27-30
第二部分 间充质干细胞上调哮喘小鼠外周血CD4+CD25+调节性T 细胞减轻气道炎症  30-46
  材料和方法  31-33
  结果  33-36
  讨论  36-40
  参考文献  40-46
第三部分 间充质干细胞对去除CD4+CD25+调节性T 细胞哮喘小鼠气道炎症的影响  46-61
  材料和方法  46-49
  结果  49-54
  讨论  54-57
  参考文献  57-61
小结和结论  61-62
本实验的不足之处和未来展望  62-63
附录（一）论文相关图片  63-71
附录（二） 在学期间参与的已发表或待发表的文章  71-74
致谢  74-76

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 呼吸系及胸部疾病 > 气管和支气管疾病 > 支气管疾病 > 支气管哮喘
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