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TrkB基因修饰NSCs移植促进脊髓损伤大鼠组织修复超微结构观察

作　者: 代广辉
导　师: 徐如祥
学　校: 第一军医大学
专　业: 神经外科学
关键词: 骨髓基质细胞神经干细胞细胞移植脊髓损伤蛋白酪氨酸激酶B
分类号: R651.2
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

脊髓损伤（Spinal cord injury，SCI）是一种严重伤病，其致残率极高。SCI的传统治疗方法有脊柱骨折脱位的复位固定、解除压迫、对症、预防并发症及功能康复锻炼治疗。近年来，随着神经病理生理及神经发育学研究的不断深入，神经组织不能再生的传统观念受到了挑战，神经组织细胞移植逐渐应用于SCI的治疗并取得了肯定的效果。神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）特别是骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）源性NSCs分化调控和移植修复SCI成为研究重点。BMSCs是骨髓细胞中除去造血干细胞之外的细胞部分，目前已证实BMSCs在特定的培养条件下可分化成多种细胞，如间充质细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞和神经元及神经胶质细胞等，具有克隆样增殖特性。其可向神经细胞方向分化的潜能，为NSCs的来源增加了一个新的途径，同时因为其获取方便、来源充足、可进行自体移植、避免了使用胚胎干细胞所带来的伦理争议和免疫排斥反应等优势，因此成为SCI后细胞移植替代治疗最理想的种子细胞来源之一。目前国内外众多实验结果表明：NSCs移植可以促进SCI后组织修复及功能改善，但目前尚未有移植细胞与宿主细胞问形成突触联系的报道，即尚未发现移植细胞可以重建神经环路、恢复中断的神经纤维。究其原因，主要是目前的细胞标记方法仅能标记细胞胞体，但不能有效标记移植细胞发出的轴突、树突等结构，尤其是在电镜观察超微结构时，不能区分轴突或者树突的来源。目前Ferumoxides是作为移植细胞的标记物受到广泛的关注，其和多聚赖氨酸（poly 1 lysine，PLL）形成的FE-PLL复合物可以有效标记移植细胞，且由于其颗粒细小，有可能会随着胞浆在轴突、树突中的运输过程而扩散到轴突、树突的末端，在电镜下可以区分轴突及树突是来源于移植细胞还是来源于宿主细胞。而TrkB受体作为细胞膜上的受体，在正常的神经组织细胞中有少量分布，并且分布于轴突、树突的末端甚至突触部位，因此，如果给予外源性TrkB一个宿主细胞不存在的标记物，并且此标记物可以在电镜下清楚显示，也可以据此在电镜下辨别轴突及树突的来源。本研究以BMSCs源性NSCs为移植细胞，建立脊髓全横断损伤大鼠模型，通过脂质体法转染pEGFP-C₂-TrkB至NSCs，其中以EGFP作为外源性TrkB的报告基因，并在细胞移植前再以FE-PLL进行了标记，以方便影像学活体追踪及动物实验的电镜下细胞辨认。将携带pEGFP-C2-TrkB质粒并用FE-PLL标记的NSCs移植到损伤SCI处，获取病理组织，通过胶体金标记的EGFP免疫组化及含铁颗粒在细胞内分布来观察移植的NSCs存活、分化及与宿主细胞间是否存在突触或其它方式的联系，并通过生物素化的葡聚糖胺（Biotinylated dextran amine，BDA）顺行追踪皮质脊髓束以观察神经纤维能否再通，即神经环路能否重建，从而观察NSCs移植促进SCI组织修复的超微结构证据。第一部分大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化成神经元样细胞的实验研究目的：观察9L／fisher944同源基因型大鼠BMSCs在体外培养及诱导分化获得神经元样细胞的可行性。材料及方法：（一）、无菌条件下获取大鼠骨髓，梯度密度离心BMSCs。（二）、在体外应用NSCs培养基（专利号：ZL02134314.4）和细胞因子进行BMSCs向NSCs、神经元样细胞的诱导分化。细胞培养中分别加入维甲酸（retinoic acid，RA）等细胞因子。（三）、观察培养细胞：CK2型倒置相差光学显微镜（OLYMPAS，JAPAN）追踪观察细胞生长情况并拍照；采用SABC法进行免疫细胞化学检测（一抗分别为鼠抗-Nestin、鼠抗-NSE，二抗试剂盒为生物素化羊抗鼠IgG，链霉亲和素-生物素-过氧化酶复合物，DAB显色）。结果：（一）、贴壁细胞培养48h后有分裂增殖，然后逐渐形成岛屿状细胞克隆团，给予适当的分化条件10～20d后，这些细胞能分化成具有细长突起、多种形态的细胞。（二）、经免疫细胞化学鉴定，早期的培养细胞在没有给予诱导分化时可阳性表达Nestin，表明具有干细胞特性；培养细胞经诱导分化后有神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）阳性表达的细胞出现。结论：大鼠BMSCs是具有较强自我更新能力和多向分化潜能的细胞，在一定条件下，可分化为NSCs并分化为神经元样细胞，表达神经组织细胞特异性抗原。RA在BMSCs向神经元样细胞分化的过程中起着积极作用。BMSCs可作为NSCs的来源细胞。第二部分：大鼠骨髓基质细胞源性神经干细胞的TrkB基因转染目的：通过基因转染，获得能长期稳定表达TrkB基因的NSCs，同时评价脂质体法的转染效率及转基因后蛋白的表达情况。方法：采用LIPOEECTAMINE．2000脂质体介导法，将真核表达载体pEGFP-C₂-TrkB导入NSCs。转染24h后，荧光显微镜下观察标记蛋白—EGFP的表达情况，计算转染效率。应用含G418的选择培养基对细胞进行筛选，获得转染阳性细胞。通过半定量RT-PCR法测定转染阳性NSCs中TrkB mRNA的表达水平。通过TrkB免疫细胞化学荧光染色观察目的基因在蛋白水平的表达情况。取同期培养未转染及经相同方法转染pEGFP-C₂的NSCs作为对照组。结果：经LIPOEECTAMINE．2000脂质体法转染后24h小时后，荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白的表达，表达率约18.12±0.63％，随着培养时间的延长，表达绿色荧光蛋白的细胞数量逐渐增多，于一周左右达到高峰，表达率约40.19±0.70％，继续观察一个月未发现荧光表达减弱。转染一周后，更换含有浓度为500ng／L G418的选择培养基进行筛选，常规培养，5d后未转染组的细胞全部死亡，转染pEGFP-C2-TrkB及pEGFP-C₂组中可见较多细胞从培养瓶壁上脱落、死亡。5d后开始以浓度为300ng／L G418的选择培养基继续筛选20d以上。半定量法RT-PCR法测定细胞中TrkB mRNA相对表达水平，结果显示转染pEGFP-C₂-TrkB组明显高于转染pEGFP-C₂组及未转染组（P＜0.001）。TzkB免疫细胞化学荧光染色后共聚焦显微镜检测发现，转染pEGFP-C₂-TrkB质粒后细胞上的TrkB表达主要集中在细胞膜上。结论：本实验通过脂质体介导的方法将pEGFP-C₂-TrkB转染入NSCs中，获得稳定表达外源TrkB基因的抗G418细胞克隆，并从蛋白及mRNA水平证实了转染后的NSCs可大量表达外源TrkB，表达主要集中在细胞膜上。LIPOEECTAMINE．2000脂质体法转染操作简便、转染效率可以满足实验要求；EGFP可以作为大鼠TrkB有效的基因表达标记。第三部分：菲立磁标记大鼠神经干细胞的细胞生物学研究目的：利用神经影像学在体追踪移植入宿主体内的NSCs无疑能够帮助我们正确评价移植细胞对功能恢复的调节情况。Ferumoxides是一种超顺磁性氧化铁，是磁共振的对比造影剂。本研究旨在初步探索利用Ferumoxides标记大鼠NSCs及对其活力、增殖的影响，并观察标记成功后含铁颗粒在细胞里的分布情况，为临床和基础研究利用磁共振成像追踪标记细胞及根据含铁颗粒在细胞内的分布以区分移植细胞和宿主细胞的轴突及树突奠定基础。方法：按第一部分方法获得NSCs，将终浓度25μg／ml的Ferumoxides和终浓度0.75μg／ml PLL混合振荡30min形成Ferumoxi des和PLL的复合物（FE-PLL），应用FE-PLL标记NSCs，采用普鲁士兰染色和投射电镜对细胞内铁分布和标记效率进行检测，采用四唑盐（MTT）法鉴定FE-PLL标记NSCs活力。应用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行分析，分析该标记方法对NSCs活力、增殖的影响。实验分组：A．纯NSCs组；B．PLL（0.75μg／ml）组；C．FE（25μg／ml）组；D．FE（25μg／ml）+PLL（0.75μg／ml）组。结果：倒置相差显微镜观察：FE-PLL标记组NSCs呈黄色，而PLL孵育组、FE组及正常未标记组细胞未见黄染，之间区别明显。经FE—PLL标记的NSCs普鲁士兰染色阳性率均在90％以上。倒置显微镜下观察，普鲁士蓝染色阳性标记的NSCs胞质内存在细小的蓝色铁颗粒，细胞呈蓝色，主要集中在胞体，而PLL孵育组、FE组及正常未标记组细胞未见细胞蓝染。透射电镜结果显示，FE-PLL标记阳性的NSCs胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡，直径在0.8～1.5μm，囊泡内有浓聚细小的铁颗粒，主要集中在胞体。MTT结果显示，FE-PLL标记细胞与PLL孵育组、FE组及正常未标记组细胞相比，吸光度值差异无显著性，说明FE-PLL复合物在此浓度下对细胞活力无显著影响，表明应用FE-PLL作为NSCs的标记物是安全的。流式细胞仪检测结果显示，FE-PLL标记细胞与单纯PLL孵育组、单纯FE组及正常未标记组细胞相比，细胞凋亡率的差异无显著性，说明FE-PLL复合物在实验浓度下对细胞的凋亡无显著影响。结论：FE-PLL标记的NSCs经普鲁士蓝染色及电镜检测均显示其胞质内含铁颗粒的存在，含铁颗粒主要分布于胞体上。MTT及流式细胞仪结果结果显示，Ferumoxides终浓度25μg／ml、PLL终浓度为0.75μg／ml时，FE-PLL复合物对细胞增殖及凋亡没有明显影响；含铁颗粒分布在胞浆内，可能会随着胞浆运输而分布至细胞的轴突或者树突中，依此可能区分轴突及树突的来源，但也需体内实验的进一步证实；用FE-PLL体外标记NSCs是一种可行的实验方案，可考虑用于移植细胞的活体追踪。第四部分：TrkB基因修饰NSCs移植促进SCI大鼠组织修复超微结构观察目的：建立9L／fisher944同源基因型大鼠胸8节段脊髓横断损伤模型，将体外FE-PLL标记的携带pEGFP-C₂-TrkB基因的NSCs经单细胞悬液微移植入体内，以体外FE-PLL标记的携带pEGFP-C₂的NSCs以及单纯FE-PLL标记的NSCs移植为对照组，观察移植细胞在脊髓损伤处的存活、迁移、分化情况及与宿主组织细胞的整合情况，尤其是移植细胞与宿主细胞间联系的存在情况，为细胞移植治疗SCI寻找超微结构的证据。方法：采用全横断法制作胸8节段SCI动物模型，并根据处理方式的不同将实验动物分为五组：A组：正常对照组；B组：单纯SCI组；C组：SCI+单纯NSCs移植组；D组：SCI+携带pEGFP—C2的NSCs移植组；E组：SCI+携带pEGFP-C2-TrkB的NSCs移植组。在细胞移植后4周应用磁共振成像对移植细胞进行活体示踪（C、D、E组），A、B组作为对照组。同时对移植细胞生存、分化状态检测：D、E组中，荧光显微镜下挑选有EGFP表达的组织切片，行抗-NSE及抗-GFAP免疫组化荧光染色（Cy3）；细胞存活数，移植细胞分化的NSE、GFAP阳性细胞计数、GFAP阳性细胞计数，其中GFAP阳性细胞计数比较中A、B、C组作为对照。通过普鲁士蓝染色及透射电镜对移植细胞内铁进行鉴定和观察。应用BDA法顺行追踪皮质脊髓束观察中断的神经纤维再通的情况。实验重点在于移植细胞与宿主细胞间整合情况的超微结构观察，即是否存在突触等联系，应用方法用两种：第一种，应用透射电镜观察含铁颗粒是否能分布至轴突、树突，能否以此来观察移植细胞与宿主细胞间整合情况的超微结构：第二种方法GFP免疫组化（二抗为胶体金标记）来观察外源性TrkB的标记物一EGFP的蛋白表达情况，根据胞膜、轴突、树突上是否存在胶体金颗粒来区分移植细胞及其轴突、树突，以此来观察移植细胞与宿主细胞间整合情况的超微结构。结果：FE-PLL细胞移植入体内后，可以在MRI上清楚显像，在T1W1序列上主要表现为损伤区域轻度升高的信号，而单纯的损伤区为低信号改变。MRI显像区域经组织切片普鲁士蓝染色及透射电镜观察证实了细胞内铁的存在。移植的细胞在体内可以存活并分化为表达NSE、GFAP的细胞，其中以表达GFAP的细胞数量为多，TrkB的转染可以增加移植细胞的存活及向NSE阳性细胞的分化、减少向GFAP阳性细胞的分化，可以在一定程度上减轻脊髓损伤后胶质瘢痕的程度，间接发挥了BDNF的生物学效应，有利于神经组织的再生及修复。BDA法证实细胞移植可以促进神经纤维的再通及中断的神经环路的重建，而TrkB的转染可以增加这种作用。超微结构的观察发现应用FE-PLL标记细胞的方法可以在电镜下有效的辨别出移植细胞胞体，但由于含铁颗粒不能随胞浆运输而转运至轴突及树突内，因此，不能区分轴突及树突的来源，只能确切的观察移植细胞与宿主细胞胞体问的联系。而通过给予外源性TrkB受体一个宿主自身没有的标记蛋白-EGFP，通过免疫组化定位EGFP蛋白，由于TrkB受体可以分布至轴突、树突甚至突触前膜上，因此应用此方法可以在电镜下确切的区分出移植细胞形成的轴突及树突，据此可以明确的了解移植细胞与宿主细胞间的整合情况。透射电镜下发现部分细胞膜有散在的高密度胶体金颗粒，分布基本均匀一致，部分细胞突起上存在类似的高密度金属颗粒，胶体金标记的细胞突起与铁标记的细胞胞体间有较多的接触，胶体金标记的细胞突起与没有铁标记的细胞胞体间形成的接触少，胶体金标记的细胞突起与无胶体金标记的细胞突起间也存在着接触，但均未形成典型的突触样结构。小结：1．FE-PLL标记的NSCs移植入体内后可以通过MRI活体观察、追踪，但在电镜下不能区分轴突及树突的来源；2．给予外源性TrkB特殊的标记蛋白—EGFP后，予胶体金标记的免疫组化蛋白定位，可以在电镜下区分轴突及树突是否来源于移植细胞，并可以依此观察移植细胞与宿主细胞间的整合情况；3．NSCs移植入大鼠SCI模型后可以在移植部位能在存活，可分化为表达NSE及GFAP的细胞，但分化的细胞以表达GFAP者为多；通过转染TrkB，可以间接的发挥BDNF的生物学作用，促使移植的NSCs分化为表达NSE细胞的比例增高，减少向表达GFAP细胞分化的比例，在一定程度上减少胶质瘢痕的程度；4．移植入体内的NSCs与宿主细胞间可以形成接触、联系，但未发现典型的突触样结构，BDA追踪皮质脊髓束证实，中断的皮质脊髓束在细胞移植后可以不同程度的得以再通，神经环路得以重新构建，转染TrkB到移植细胞上可以强化神经纤维的再通；5．NSCs移植治疗SCI有一定的疗效，但仍有许多问题需要解决。

全文目录

中文摘要  3-10
ABSTRACT  10-23
前言  23-27
第一部分大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化成神经元样细胞的研究  27-37
  引言  27
  材料与方法  27-31
  结果  31-32
  讨论  32-35
  第一部分小结  35
  参考文献  35-37
第二部分大鼠骨髓基质细胞源性神经干细胞的TrkB基因转染  37-51
  引言  37-38
  材料与方法  38-46
  结果  46-47
  讨论  47-49
  第二部分小结  49
  参考文献  49-51
第三部分菲立磁标记大鼠神经干细胞的细胞生物学研究  51-64
  引言  51-52
  材料和方法  52-54
  结果  54-56
  讨论  56-60
  第三部分小结  60
  参考文献  60-64
第四部分 TrkB基因修饰NSCs移植促进脊髓损伤大鼠组织修复超微结构观察  64-88
  引言  64-65
  材料与方法  65-71
  结果  71-74
  讨论  74-82
  第四部分小结  82-83
  参考文献  83-88
全文小结  88-89
附图  89-103
综述一  103-109
综述二  109-116
中英文缩略词表  116-117
在读期间参与编写的文章  117-118
致谢  118-119

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