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慢性乙型肝炎患者肠道菌群结构

作　者: 刘嘉颀
导　师: 赵立平
学　校: 上海交通大学
专　业: 微生物学
关键词: 肠道菌群慢性乙型肝炎 LPS bar coded 454测序 16S rRNA基因V3区多变量统计
分类号: R512.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

慢性乙型病毒性肝炎(Chronic Viral Hepatitis B, CHB)是一种严重危害人类健康的常见病,部分患者因肝脏炎症的反复发作可发展为肝硬化、肝癌及肝衰竭。因此,防止慢性乙型肝炎病情恶化工作也是一个全球性的公共卫生问题。近年来,肝病与肠道菌群来源的内毒素的关系日益受到人们的重视,大量的临床资料表明,慢性肝炎患者常伴发有肠源性内毒素血症,且肝脏受损程度与血清中内毒素水平呈明显的量效关系,肠道菌群在肝脏的炎症反应、肝脏的纤维化进程中起到了非常重要的作用。因此,全面深入的地解析肝炎患者的肠道菌群结构将会有利于研究慢性乙肝的病程及预后。本论文通过使用bar coded 454第二代测序技术,对300名CHB患者和149名健康对照的粪便样品进行了肠道菌群的结构分析,研究了CHB患者的肠道菌群结构特征以及疾病对肠道菌群的影响。对样品进行了16S rRNA基因的V3区的bar coded 454测序共获得的851,302条高质量的序列,通过PCA、PLS、Unifrac、SVM等多元统计分析。结果显示,CHB患者的肠道菌群结构与健康人有着明显的差别。这种差别首先表现在其肠道菌群多样性显著的降低。其次,一些优势类群的比例在两组人群中也存在显著差异,如拟杆菌门(Bacteroidetes)以及其中的机会致病菌普雷沃氏菌属(Prevotella)丰度均在CHB患者中显著增加,而厚壁菌门(Firmicutes)以及其中最优势丁酸盐产生菌罗氏菌属(Roseburia)、益生菌双歧杆菌属(Bifidobacterium)的丰度则显著降低。综上,本研究表明,CHB患者肠道菌群结构与健康人相比发生了显著的变化,表现在其多样性明显减少及一些特定细菌类群比例的失衡上。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第一章文献综述  10-42
  引言  10-11
  1.1 人体肠道菌群的结构与功能  11-18
    1.1.1 人体肠道微生物概述  11-12
    1.1.2 人体肠道菌群的主要结构组成  12-14
      1.1.2.1 厚壁菌门（Firmicutes）  12-13
      1.1.2.2 拟杆菌门（Bacteroidetes）  13
      1.1.2.3 变形菌门（Proteobacteria）  13-14
      1.1.2.4 放线菌门（Actinobacteria）  14
    1.1.3 人体肠道微生物的主要功能  14-15
      1.1.3.1 食物消化及营养代谢  14
      1.1.3.2 促进上皮细胞的生长与分化  14-15
      1.1.3.3 调节宿主的免疫功能  15
      1.1.3.4 肠屏障保护作用  15
    1.1.4 影响肠道菌群结构的因素  15-18
      1.1.4.1 宿主遗传因素  16
      1.1.4.2 免疫系统  16-17
      1.1.4.3 营养因素  17
      1.1.4.4 其他因素  17-18
  1.2 肠道菌群与疾病  18-22
    1.2.1 肠道菌群与肝脏疾病  18-20
    1.2.2 肠道菌群与其他疾病  20-22
      1.2.2.1 肠道菌群与炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）  20-21
      1.2.2.2 肠道菌群与结肠癌（colon cancer）  21
      1.2.2.3 肠道菌群与代谢综合征（Metabolic Syndrome, MS）  21-22
  1.3 研究微生物群落组成结构的分子生物学技术  22-25
    1.3.1 变性/温度梯度凝胶电泳技术（DGGE/TGGE）  23
    1.3.2 克隆文库分析法（clone library）  23-24
    1.3.3 454 测序技术（454 pyrosequencing）  24-25
  1.4 多变量统计学方法  25-29
    1.4.1 主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）  26-27
    1.4.2 聚类分析（Cluster Analysis）  27
    1.4.3 最小二乘法（Partial Least Square, PLS）  27-28
    1.4.4 UniFrac 分析  28-29
    1.4.5 支持向量机（Support Vector Machines, SVM）  29
  1.5 论文结构介绍  29-31
  1.6 参考文献  31-42
第二章利用454 测序技术对慢性乙型肝炎患者肠道菌群结构的研究  42-91
  摘要  42-43
  ABSTRACT  43-44
  引言  44-45
  2.1 材料与方法  45-58
    2.1.1 人群信息及招募方案  45-48
      2.1.1.1 CHB 组排除纳入标准  45-46
      2.1.1.2 健康对照排除纳入标准  46-48
    2.1.2 CHB 患者生物样本采集  48-49
      2.1.2.1 血样采集  48
      2.1.2.2 尿液采集  48-49
      2.1.2.3 粪便采集  49
    2.1.3 对大规模粪便样品细菌总基因组DNA 的提取  49
    2.1.4 CHB 粪便DNA 的165 rRNA 基因V3 区bar coded 454 测序  49-51
    2.1.5 454 序列的处理及系统发育分析  51-55
      2.1.5.1 454 序列的质控（quality control）、整理（trimming）及归并（binning）  51-52
      2.1.5.2 序列比对  52-53
      2.1.5.3 计算距离矩阵  53
      2.1.5.4 划分操作分类单元（Operation Taxonomy Unit，OTU）  53-54
      2.1.5.5 多样性分析  54-55
      2.1.5.6 系统进化树的建立  55
      2.1.5.7 分析分类地位  55
    2.1.6 肠道菌群测序数据的统计分析  55-58
      2.1.6.1 数据预处理  55-56
      2.1.6.2 人体肠道菌群结构的多变量统计学分析  56-58
  2.2 实验结果  58-69
    2.2.1 CHB 对肠道菌群多态性的影响  58
    2.2.2 CHB 与健康对照肠道菌群结构的整体比较  58-63
      2.2.2.1 主成份分析  58-61
      2.2.2.2 Unifrac 分析  61-63
    2.2.3 使用肠道菌群对CHB 及健康对照建立分类模型  63-64
      2.2.3.1 使用PLS-DA 建立分类模型评估模型  63-64
      2.2.3.2 使用SVM 法建立分类模型  64
    2.2.4 人群肠道菌群多样性组成的系统发育分析  64-68
    2.2.5 鉴定健康状况相关的特定细菌类群  68-69
  2.3 讨论  69-72
  2.4 本章小结  72-73
  2.5 参考文献  73-79
  附表1 CHB 患者及健康对照其肠道菌群454 测序信息  79-91
附章造血干细胞移植术对肠道菌群结构的影响  91-103
  引言  91-92
  3.1 材料与方法  92-95
    3.1.1 患者资料及采集方案  92
    3.1.2 抗生素治疗方案  92-93
    3.1.3 粪便样品细菌总基因组DNA 提取  93
    3.1.4 HSCT 患者粪便DNA 的165 rRNA 基因V3 区Bar-coded 454 测序  93-94
    3.1.5 454 序列的处理及系统发育分析及肠道菌群测序数据的统计分析  94-95
  3.2 实验结果  95-100
    3.2.1 测序质量评估  95-96
    3.2.2 HSCT 期间肠道菌群多样性改变  96
    3.2.3 肠道菌群整体结构及分类地位分析  96-100
  3.3 讨论  100-101
  3.4 本章小结  101-102
  3.5 参考文献  102-103
附录1 缩写及全称  103-104
附录2 仪器设备  104-105
研究生阶段已（待）发表的论文及参加的科研课题  105-106
  已（待）发表的论文  105
  参加的科研课题  105-106
致谢  106-109

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