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桑蚕丝蛋白的微纤化和物理凝胶化研究

作　者: 龚祖光
导　师: 邵正中
学　校: 复旦大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 桑蚕丝蛋白微纤凝胶 cross-β-折叠分形可注射性水凝胶触变性细胞输运流变
分类号: Q51
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

经过亿万年对自然的适应与进化,动物(主要指蜘蛛和蚕)制造出富含β-折叠结构的“完美”纤维——动物丝。在半个多世纪的大量研究中,人们对动物丝从一级结构(氨基酸序列)到聚集态结构的完整等级结构已有初步认识,并已将其应用于制备各种宏观尺度的材料上。淀粉样微纤是另一类富含p-折叠结构的蛋白质纤维,其虽然最初发现于病变组织中,但是随着越来越多非致病性蛋白质被发现能够形成淀粉样微纤,人们极大地拓宽了将基于β-折叠蛋白质的结构性材料发展成一类重要天然生物材料的潜在原料来源。然而,如何将淀粉样微纤在纳米尺度上的等级结构转化成宏观材料仍面临着巨大的挑战。本论文以桑蚕丝蛋白为研究对象,对其物理凝胶化和微纤化进行了细致研究,探索了多种调控p-折叠(高等级)结构形成的手段,并初步探讨了桑蚕在吐丝结茧前防止腺体内丝蛋白过早形成β-折叠结构的主动调控机制,希冀对富含β-折叠蛋白质材料的结构调控有所启示。我们首先通过改变制备条件,得到了两种p-折叠结构不同的丝蛋白(SF)微纤：1)在静态乙醇/水溶液中,丝蛋白自组装成"cross-β"结构(分子链方向与纤维轴向垂直)的纳米微纤；2)在剪切力存在的水溶液中,丝蛋白自组装成‘’parallel-β"结构(分子链方向与纤维轴向平行)的微纤。通过进一步比较两种微纤中β-折叠结构的差别表明,对于乙醇/水溶液中形成的SF纳米微纤,在其“连续”的cross-β-折叠结构中,沿氢键方向排列的分子链数目应该至少在15根以上；而剪切诱导下形成的SF微纤,其p-折叠结构中,沿氢键方向排列的分子链数目可能大多分布在4-10根范围内,且被未形成β-折叠结构或所形成β-折叠结构并不完善的分子链段隔开。我们还通过对丝蛋白氨基酸序列(由5263个氨基酸残基组成)的分析,提出了丝蛋白"cross-p"纳米微纤的结构模型。本研究中所提出的利用机械外力(如剪切力)来调控蛋白质纤维结构的方法,为设计新型的以β-折叠结构为主的蛋白质(多肽)纤维材料提供了新的思路。接着,我们研究了乙醇诱导所形成丝蛋白凝胶的等级结构及其生成动力学。结果表明,丝蛋白醇凝胶是一类由纳米微纤和絮状物分别在纳米和微米尺度上形成网络结构的复杂二元分形体。通过动力学分析得到微纤簇的分形维数在2.4-2.8之间,并随丝蛋白起始浓度的增大而增大。通过标度分析得到的“絮状网络”的分形维数为2.2。丝蛋白的微纤化遵循成核-增长机制,微纤在生长过程中不断的发生分叉或缠绕,形成微纤簇,同时,由不同的“核”生长形成的微纤簇,最终相互交叠聚集,导致絮状网络结构的形成。研究结果还表明,微纤化和凝胶化的动力学过程同时受制于乙醇和SF的浓度。提高乙醇的浓度,可以加速微纤化的成核过程,但是不同乙醇浓度下形成的微纤簇结构相似。SF的浓度不但影响凝胶动力学,还影响到最终形成的凝胶的机械性能,如凝胶的弹性模量和在大应变下的应变硬化程度。我们还发展了一种新型的SF-HPC(羟丙基纤维素)共混水凝胶,其可在37。C的温和条件下形成,且具有触变性而成为一种可注射的凝胶。通过动态流变学、激光共聚焦扫描显微镜、拉曼光谱和核磁共振等技术对凝胶的表征,我们提出SF-HPC共混水凝胶如下可能的形成机制：1)从室温升至37。C时,具有LCST的HPC分子链间的疏水相互作用增强,诱导共混体系发生经由成核-生长机制进行的相分离；相分离导致SF富集相的产生,促使SF发生由无规线团向p-折叠结构的转变；2)相结构发生粗大化,与此同时,由SF所形成的p-折叠结构逐渐增加,直到贯穿体系的凝胶网络形成；3)SF分子中的β-折叠结构进一步增加和完善,提供更多的交联点,使凝胶网络得以发展,而处于分散相中的分子链运动受限,导致相结构的粗大化无法进一步进行,使已形成的相结构最终被“冻结”下来。通过改变共混体系的组成,能够对SF-HPC共混水凝胶的相分离和凝胶化动力学进行控制,进而实现对凝胶微观形貌、机械强度和触变性的调控。增加共混体系中SF的含量可以缩短凝胶时间,并改变凝胶点附近的凝胶性质。大振幅振荡剪切(LAOS)实验的结果表明,混合比为7/3(SF/HPC)的水凝胶,在大剪切下可能经历了“β-折叠结构富集域间的弹性形变-富集域间弱交联点被破坏-富集域的滑移-弱交联点重建”的过程,使得此组成下的水凝胶具有显著的触变性。我们利用该混合比下的SF-HPC共混水凝胶成功实施了对细胞(如L929成纤维细胞)的包埋,并证明水凝胶在注射过程中对细胞有一定的保护作用,同时,细胞在经注射凝胶中的分布仍较为均匀。由于构成凝胶的两种组份均具有良好的生物相容性和生物可降解性,致使此类可注射水凝胶在药物和细胞输运载体等生物医用领域有着广泛的应用前景。最后,我们研究了“凝胶状”的天然桑蚕纺丝原液的流变性能,发现液晶态的纺丝原液在流动类型上属于翻滚型(tumbling),因此在中等剪切速率下呈现负的第一法向应力差,并在起始流中表现出粘度(应力)和第一法向应力周期性振荡的流变行为。通过对振荡周期的分析,我们计算出决定向列型液晶流动类型的参数λ,其绝对值为0.996,表明丝蛋白分子在形成液晶时形状上具有很大的各向异性。结合不同流变学实验的结果,并借鉴超分子液晶基元模型,我们提出了天然纺丝原液受到剪切作用时从静止到流动过程的三种状态：1)静态时,丝蛋白分子间可能通过超分子相互作用形成“瞬态网络”(其模量在1.2×104-2.0×104Pa之间,其松弛时间在0.5-3s之间),此时液晶基元包含于网络中；2)当纺丝原液受到剪切力作用时,丝蛋白分子之间的相互作用部分被破坏,高弹性的“瞬态网络”开始变软；3)当剪切力进一步增加时,“瞬态网络”的结构被完全破坏,原来构成网络的丝蛋白超分子液晶基元开始沿剪切方向流动,并进行翻滚。我们推测丝蛋白液晶基元在中等剪切速率下的翻滚,可能有助于动物纺丝前避免丝蛋白分子在腺体中过早发生构象转变(形成β-折叠结构)并固化,进而起到稳定纺丝原液的作用。此部分的研究结果深化了我们对天然动物纺丝机理的理解,并对人工纺丝具有指导意义。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-11
目录  11-14
第一章绪论  14-44
  1.1 富含β-折叠结构的蛋白质纤维  15-23
    1.1.1 纤维的等级结构  15-19
      1.1.1.1 动物丝纤维的等级结构  15-17
      1.1.1.2 淀粉样微纤的等级结构  17-19
    1.1.2 纤维化机理  19-23
      1.1.2.1 动物纺丝过程及成丝机理  19-22
      1.1.2.2 淀粉样微纤的微纤化机理  22-23
  1.2 富含β-折叠结构的蛋白质水凝胶  23-29
    1.2.1 动物丝蛋白水凝胶  23-28
      1.2.1.1 桑蚕丝蛋白的凝胶化机理及影响凝胶化的因素  23-25
      1.2.1.2 桑蚕丝蛋白水凝胶的共混改性  25-26
      1.2.1.3 桑蚕丝蛋白电凝胶  26
      1.2.1.4 桑蚕丝蛋白水凝胶的应用  26-27
      1.2.1.5 其他动物丝蛋白凝胶  27-28
    1.2.2 淀粉样微纤水凝胶  28-29
  1.3 桑蚕丝蛋白概述  29-32
    1.3.1 桑蚕丝及其丝蛋白  29-30
    1.3.2 桑蚕丝蛋白的一级结构  30-31
    1.3.3 桑蚕丝蛋白的二级结构及聚集态结构  31-32
  1.4 课题的提出以及研究目的和主要内容  32-34
  参考文献  34-44
第二章基于丝蛋白的β-折叠微纤的研究  44-62
  2.1 引言  44-45
  2.2 实验部分  45-48
    2.2.1 材料与试剂  45
    2.2.2 丝蛋白微纤的形成  45
    2.2.3 样品表征  45-48
      2.2.3.1 冷冻透射电镜(cryo-TEM)  46
      2.2.3.2 透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)  46
      2.2.3.3 原子力显微镜(AFM)  46
      2.2.3.4 二维广角X-射线衍射(2D-WAXD)  46-47
      2.2.3.5 拉曼光谱(Raman)  47
      2.2.3.6 Thioflavin T(ThT)及Congo Red(CR)结合实验  47-48
  2.3 结果与讨论  48-58
    2.3.1 丝蛋白微纤的形貌  48-50
    2.3.2 丝蛋白微纤的二级结构和聚集态结构  50-57
    2.3.3 丝蛋白cross-β-折叠微纤的结构模型  57-58
  2.4 本章小结  58-59
  参考文献  59-62
第三章丝蛋白醇凝胶的结构与生成动力学研究  62-86
  3.1 引言  62-63
  3.2 实验部分  63-65
    3.2.1 材料与试剂  63
    3.2.2 样品制备  63
    3.2.3 样品表征  63-65
      3.2.3.1 透射电镜(TEM)  63
      3.2.3.2 原子力显微镜(AFM)  63-64
      3.2.3.3 冷冻透射电镜(cryo-TEM)  64
      3.2.3.4 共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)  64
      3.2.3.5 ThT荧光动力学测试  64-65
      3.2.3.6 动态流变学测试  65
  3.3 结果与讨论  65-80
    3.3.1 丝蛋白醇凝胶的形貌(内部结构)观察  65-70
      3.3.1.1 丝蛋白醇凝胶形成过程的TEM和AFM观察  65-68
      3.3.1.2 丝蛋白醇凝胶原位结构的cryo-TEM和CLSM观察  68-70
    3.3.2 丝蛋白醇凝胶的动力学研究  70-74
      3.3.2.1 醇凝胶中丝蛋白微纤化的动力学研究  70-72
      3.3.2.2 丝蛋白醇凝胶粘弹性的动力学研究  72-74
    3.3.3 丝蛋白醇凝胶分形结构的研究  74-80
      3.3.3.1 基于Avrami方程的分形分析  75-77
      3.3.3.2 基于标度理论的分形分析  77-80
  3.4 本章小结  80-81
  参考文献  81-86
第四章可注射的再生丝蛋白-羟丙基纤维素水凝胶  86-124
  4.1 引言  86-88
  4.2 实验部分  88-91
    4.2.1 材料与试剂  88-89
    4.2.2 样品制备  89-90
      4.2.2.1 丝蛋白溶液、羟丙基纤维素溶液和共混溶液的制备  89
      4.2.2.2 罗丹明B标记的丝蛋白溶液的制备  89
      4.2.2.3 荧光素标记的羟丙基纤维素及SF-HPC共混溶液的制备  89-90
    4.2.3 样品表征  90-91
      4.2.3.1 动态流变学测试  90
      4.2.3.2 共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)  90
      4.2.3.3 定量~(13)C核磁共振(~(13)C-NMR)  90
      4.2.3.4 拉曼光谱  90-91
    4.2.4 细胞培养及细胞存活性检测  91
  4.3 理论部分  91-92
    4.3.1 sol-gel转变点的流变学行为及判据  91-92
    4.3.2 凝胶点附近的标度律  92
  4.4 结果与讨论  92-115
    4.4.1 SF-HPC共混体系溶液-凝胶转变过程的流变学研究  92-95
    4.4.2 SF-HPC共混体系的时间-固化叠加及凝胶点附近的标度分析  95-98
    4.4.3 SF-HPC共混体系凝胶化机制的研究  98-105
      4.4.3.1 SF-HPC共混水凝胶形貌的观察  98-100
      4.4.3.2 SF-HPC共混水凝胶的定量~(13)C核磁共振研究  100-103
      4.4.3.3 SF-HPC共混水凝胶的拉曼光谱研究  103-104
      4.4.3.1 SF-HPC共混体系的凝胶化机制  104-105
    4.4.4 SF-HPC共混水凝胶的触变性及LAOS流变行为研究  105-114
      4.4.4.1 SF-HPC共混水凝胶的触变性  105-109
      4.4.4.2 SF-HPC共混水凝胶的LAOS流变行为  109-114
    4.4.5 SF-HPC共混水凝胶在注射过程中对细胞的保护能力  114-115
  4.5 本章小结  115-117
  参考文献  117-122
  附表4.2,4.3  122-124
第五章天然桑蚕纺丝原液的流变学研究  124-140
  5.1 引言  124-125
  5.2 实验部分  125-126
    5.2.1 桑蚕纺丝原液的提取  125-126
    5.2.2 流变学测试方法  126
  5.3 结果与讨论  126-136
    5.3.1 桑蚕纺丝原液的线性粘弹性  126-127
    5.3.2 桑蚕纺丝原液的非线性粘弹性  127-135
      5.3.2.1 桑蚕纺丝原液的稳态剪切流变行为  127-130
      5.3.2.2 桑蚕纺丝原液的瞬态剪切流变行为  130-132
      5.3.2.3 桑蚕纺丝原液的LAOS流变行为  132-135
    5.3.3 对桑蚕纺丝原液液晶态形成机制与流动特性的讨论  135-136
  5.4 本章小结  136-137
  参考文献  137-140
第六章博士论文工作总结  140-143
博士期间论文发表情况  143-144
致谢  144-145

桑蚕丝蛋白的微纤化和物理凝胶化研究

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