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瓜叶菊PCFH基因对花青素苷合成及花色的影响

作　者: 孙翊
导　师: 戴思兰
学　校: 北京林业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: PCFH基因瓜叶菊类黄酮3’,5’-羟基化酶花青素苷花色
分类号: S682.11
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

瓜叶菊(Senecio cruentus Masson ex L’Herit)是菊科千里光属广泛栽培的多年生草本花卉。其花色变异丰富,其中含有菊科植物中较为稀有的典型蓝色花资源。对瓜叶菊花色形成和调控机理的研究将有助于理解菊科植物蓝色花形成的机理,也将为包括培育蓝色菊花(Chrysanthemum×morifolium,Ramat.)在内的花色改良和创新的分子育种工作奠定基础。PCFH基因是从瓜叶菊中分离出的F3’5’H基因的同源序列。本文作者选取瓜叶菊‘小丑’系列(Senecio cruentus’Jester’Serises)的鹅黄色、白色、粉色、胭脂红色和蓝色5个品种作为试验材料,以烟草‘NC89’(Nicotiana tabacum‘NC89’)作为外源基因表达的受体植物材料,围绕PCFH基因功能开展相关研究。获得如下成果：1.采用目视测色法、RHSCC比色法和色差仪测定法分析不同花色品种瓜叶菊花序发育过程中表型变化情况。在定义并区分不同的花色表型的基础之上,利用HPLC-PAD/DAD方法对5种花色瓜叶菊花序发育过程中类黄酮化合物含量的变化情况进行分析。结果表明,鹅黄色和白色瓜叶菊舌状花的主要呈色物质为花黄素,而粉色、胭脂红色和蓝色瓜叶菊舌状花的主要呈色物质为花青素苷,说明瓜叶菊舌状花的花色表型与类黄酮的种类及含量直接相关。2.利用HPLC-ESI-MS方法对瓜叶菊含有的花青素苷成分进行分析,发现在胭脂红色瓜叶菊中含有4种矢车菊色素苷和1种飞燕草色素苷(含量极低)；在粉色中含有8种天竺葵色素苷和1种矢车菊色素苷；在蓝色中含有3种飞燕草色素苷和1种矢车菊色素苷。粉色、胭脂红色和蓝色瓜叶菊舌状花中的主要花青素苷元分别是天竺葵素、矢车菊素和飞燕草素。这一结果说明,在以花青素苷为主要呈色物质的瓜叶菊舌状花中,舌状花中所含的主要花青素苷元种类对花色表型起决定性作用。3.通过RT-PCR方法对5种花色和7个级别瓜叶菊舌状花中花青素苷合成关键基因的表达情况进行检测,发现PCFH仅在蓝色花发育早期阶段表达。这一结果表明PCFH是瓜叶菊舌状花中飞燕草素合成并进而形成蓝色表型的关键基因。4.利用农杆菌介导的叶盘转化法将外源基因PCFH转化烟草。对获得的14株转基因烟草T0代植株的分析表明转基因植株花色表型表现为亮度降低、色彩加深、出现变红和变蓝现象。HPLC-ESI-MS分析显示,转基因植株花冠中有新的飞燕草色素苷生成。这一结果证明,PCFH基因编码的F3’5’H蛋白具有3’,5’-羟基化功能,能够在植物体内催化产生新的飞燕草素。5.对转PCFH基因T1代植株分析发现,其花色表型与T0代相似。统计学分析结果表明,其与野生型相比,转基因植株在花色表型及飞燕草色素苷和矢车菊色素苷的含量上均有显著性变化。此结果显示,经过有性繁殖过程,外源基因PCFH能够稳定遗传并正常行使其功能；瓜叶菊F3’5’H在植物体内不仅具有3’,5’-羟基化功能,也可能同时具有3’-羟基化功能。上述研究结果表明,PCFH在瓜叶菊花青素苷生物合成及花色形成过程中具有要作用,异源调控表达这一基因可以有效改变花色。本试验首次研究了在植物体内异源表达属于CYP75B亚家族的菊科植物特异F3’5’H编码基因的情况,并首次证明了PCFH编码的瓜叶菊F3’5’H在植物体内不仅具有3’,5’-羟基化功能,并推测其同时具有3’-羟基化功能。这些数据也为研究属于CYP75B亚家族的菊科植物特异的F3’5’H在植物体内的功能提供了新的证据。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
英文缩略表  7-12
1 绪论  12-34
  1.1 花色及其形成的物质基础  12-22
    1.1.1 花色  12
    1.1.2 花色素的类群  12-13
    1.1.3 花青素苷的结构和功能  13-15
    1.1.4 花青素苷生物合成途径及其关键酶  15-20
    1.1.5 影响花青素呈色的其它因素  20-22
  1.2 蓝色花形成关键基因F3’5’H功能研究进展  22-30
    1.2.1 F3’5’H基因在蓝色花形成中的关键作用  22
    1.2.2 F3’5’H基因的分离及序列分析  22-25
    1.2.3 F3’5’H基因的表达与花青素呈色  25
    1.2.4 F3’5’H基因的功能鉴定  25-28
    1.2.5 菊科植物F3’5’H基因分离和功能研究  28-30
  1.3 观赏植物蓝色花分子育种研究进展  30-31
  1.4 本研究的设计思想  31-33
    1.4.1 本研究的目的和意义  31-32
    1.4.2 研究设计及研究内容  32-33
  1.5 本研究的技术路线  33-34
2 瓜叶菊舌状花中色素种类和含量的分析  34-46
  2.1 材料与方法  34-38
    2.1.1 植物材料及花序发育过程中各级别的划分  34-36
    2.1.2 瓜叶菊表型测定方法  36
    2.1.3 瓜叶菊舌状花中类黄酮的提取  36
    2.1.4 瓜叶菊舌状花中类黄酮含量测定  36-37
    2.1.5 瓜叶菊舌状花花青素苷成分的定性和定量分析  37-38
  2.2 结果与分析  38-44
    2.2.1 瓜叶菊花序发育过程中表型变化分析  38-40
    2.2.2 瓜叶菊舌状花中黄素和花青素苷含量变化情况  40-42
    2.2.3 瓜叶菊舌状花中花青素苷成分分析  42-44
  2.3 讨论  44-45
  2.4 小结  45-46
3 瓜叶菊蓝色花形成关键结构基因的表达分析  46-55
  3.1 材料与方法  46-50
    3.1.1 植物材料  46
    3.1.2 舌状花总RNA的提取  46-48
    3.1.3 cDNA的合成  48-49
    3.1.4 目的基因片段的PCR扩增  49-50
  3.2 结果与分析  50-52
    3.2.1 瓜叶菊RNA提取  50
    3.2.2 cDNA的β-actin基因检测  50-51
    3.2.3 花青素苷合成关键基因表达模式  51-52
  3.3 讨论  52-54
    3.3.1 PCFH基因在蓝色瓜叶菊形成中的作用  52-53
    3.3.2 瓜叶菊PCFH基因功能的推测  53-54
  3.4 小结  54-55
4 转PCFH基因烟草T_0代植株分析  55-77
  4.1 材料与方法  55-62
    4.1.1 植物材料  55
    4.1.2 菌株及质粒  55
    4.1.3 农杆菌工程菌液的制备  55-56
    4.1.4 农杆菌介导的叶盘法转化烟草程序  56-57
    4.1.5 抗性苗的PCR及RT-PCR筛选  57-60
    4.1.6 转PCFH基因烟草植株的栽培  60
    4.1.7 烟草花色表型的测定  60-61
    4.1.8 烟草花冠中花青素苷的提取及测定  61-62
  4.2 结果与分析  62-74
    4.2.1 农杆菌菌液培养及检测  62-63
    4.2.2 抗生素阳性苗的获得  63-64
    4.2.3 抗生素阳性苗的PCR检测  64-66
    4.2.4 PCR阳性苗的RT-PCR检测结果  66-68
    4.2.5 转基因烟草T_0代植株栽培  68
    4.2.6 转基因烟草花色表型改变情况  68-70
    4.2.7 烟草花冠中花青素苷HPLC分析方法的优化  70-71
    4.2.8 转基因烟草花青素苷成分及含量变化  71-74
  4.3 讨论  74-75
    4.3.1 转化过程中农杆菌污染的控制  74
    4.3.2 外源PCFH基因对烟草中飞燕草素合成的影响  74-75
    4.3.3 外源PCFH基因烟草花色表型的影响  75
  4.4 小结  75-77
5 转PCFH基因烟草T_1代植株分析  77-90
  5.1 材料和方法  77-82
    5.1.1 植物材料  77
    5.1.2 T_0代种子抗生素筛选  77
    5.1.3 T_1代植株外源基因检测  77-81
    5.1.4 T_1代植株的栽培  81
    5.1.5 T_1代植株花色表型分析  81-82
    5.1.6 T_1代植株花冠中花青素苷分析  82
  5.2 结果与分析  82-88
    5.2.1 T_1代植株的筛选  82-83
    5.2.3 T_1代植株中外源基因PCFH鉴定  83-86
    5.2.4 T_1代植株的扩繁和栽培  86
    5.2.5 T_1代植株的表型分析  86-87
    5.2.6 T_1代植株花冠中花青素苷成分及含量分析  87-88
    5.2.7 T_1代植株花色变化情况  88
  5.3 讨论  88-89
  5.4 小结  89-90
6 PCFH基因原核表达体系的初步筛选  90-107
  6.1 材料与方法  90-96
    6.1.1 试验材料  90
    6.1.2 序列分析软件  90-91
    6.1.3 原核表达载体的构建  91-94
    6.1.4 转化菌株  94
    6.1.5 目的蛋白的诱导表达  94-95
    6.1.6 目的蛋白的SDS-PAGE检测  95-96
  6.2 结果与分析  96-106
    6.2.1 序列分析及引物设计  96-99
    6.2.2 不同长度PCFH原核表达载体的构建  99-103
    6.2.3 目的蛋白在大肠杆菌中的诱导表达  103-106
  6.3 讨论  106
  6.4 小结  106-107
7 结论  107-109
8 展望  109-111
参考文献  111-122
附录  122-130
个人简介  130-131
获得成果目录清单  131-132
导师简介  132-133
致谢  133-134

瓜叶菊PCFH基因对花青素苷合成及花色的影响

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