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二甲双胍激活腺苷酸活化蛋白激酶途径改善内皮功能的研究

作　者: 卫曼曼
导　师: 鄢文海；王留义
学　校: 郑州大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 动脉粥样硬化二甲双胍人脐静脉内皮细胞腺苷酸活化蛋白激酶一氧化氮一氧化氮合酶
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

内皮功能障碍是动脉粥样硬化(atheriosclerosis, As)血管并发症的始动环节。内皮功能障碍与大血管病变的发生、高血压和心力衰竭等心血管疾病有密切关系,其中磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)作为一种重要的蛋白激酶参与多种代谢过程,被称为是“细胞能量调节器”,能感知细胞能量代谢状态的改变,并通过影响细胞物质代谢的多个环节维持细胞能量供求平衡,在细胞内行使能量代谢调节,从而对内皮功能有重要作用。AMPK活性受AMP/ATP比值调控,被称为细胞的“代谢感受器”或调控细胞ATP和AMP水平的“燃料开关”。AMPK的长期作用可以调节相关基因的转录水平,短期作用可以调节各种能量代谢,如增加葡萄糖摄取和糖酵解,刺激脂肪酸氧化。当体内能量缺乏时,通过AMP/ATP比值调节AMPK的活性。例如在缺氧、低氧和氧化磷酸化受抑制时,肌酸／磷酸肌酸比值与AMP/ATP比值升高,AMPK可以被磷酸化和激活。当机体受到应激或者病理刺激时,AMPK可以影响脂肪酸、糖原与蛋白质的代谢过程,对心血管系统功能调节具有重要作用。在心肌及血管平滑肌,缺血、缺氧或心血管活性物质刺激时,AMPK的激活还可以通过影响细胞周期以及物质代谢,从而抑制细胞增殖。因此,AMPK在动脉粥样硬化的预防与治疗过程中具有重要作用。二甲双胍(Metformin, Met)是欧洲糖尿病研究协会(EASD)和美国糖尿病联合会(ADA)共同推荐的2型糖尿病一线用药被用来治疗糖尿病已经有50余年,其除了具有降糖作用外,还有独立于降糖作用以外的血管保护作用,能够降低心死亡率和改善慢性心力衰竭的预后,是目前为止唯一一个拥有比较坚实的心血管保护作用循证医学证据的降糖药物。因为单一使用二甲双胍可以保持体重和减少心血管事件,所以说是肥胖患者与2型糖尿病的首选药物。最近有临床研究发现,二甲双胍不仅能改善糖化血红蛋白(HbAlc)和减少2型糖尿病心血管并发症和心力衰竭的预后,还可以通过激活AMPK对心血管系统产生保护作用。但其心血管保护作用的具体分子机制目前尚不完全明确。实验目的本实验应用二甲双胍及AMPK激活剂AICAR作用于经软脂酸(Palmitic acid, PA)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC),检测二甲双胍干预前后HUCEC细胞磷酸化AMPK、eNOS的蛋白表达水平,以及培养液中NO、eNOS含量,研究二甲双胍及AMPK的激活剂AICAR对人脐静脉内皮细胞AMPK磷酸化水平、NO和eNOS含量的影响,探讨二甲双胍激活AMPK改善血管内皮及损伤的内皮功能的可能分子机制,也为有效防治糖尿病患者的心血管并发症提供新的途径和靶点。实验方法1.常规培养人脐静脉内皮细胞,并分为六组：①空白对照组(常规培养)、⑦二甲双胍(Metformin, Met) 2mmol/l组、③软脂酸(Palmitic acid, PA) 300 u mol/1组、④软脂酸300μmol/l+二甲双胍2mmol/l组、⑤5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(5-Aminoimidazole-4carboxamide-ribo-nucle-oside, AICAR) 1mmol/1组、⑥软脂酸300μmol/l+AICAR 1mmol/1组,经孵育24h后,收集细胞和培养上清液。2.采用免疫细胞化学法检测HUVEC细胞表达P-AMPK和eNOS。3.采用硝酸盐还原法检测各组培养上清液中NO的含量。4.采用ELISA法测定eNOS含量。5.采用Western Blot方法检测各组细胞的P-AMPK、eNOS蛋白的表达。6.采用SPSS16.0软件进行统计学分析。定量资料用x±s表示,多组资料间的比较采用方差分析,两两比较采用LSD的方法。检验水准α=0.05。实验结果1.一氧化氮生成量：与空白对照组(164.29±33.71μmol/L)相比,软脂酸组(76.85±18.02μmol/L)的培养液中一氧化氮生成减少;与软脂酸组相比,AICAR+PA组(159.13±38.53μmol/L)、Met+PA组(115.19±57.55μmol/L)的培养液中一氧化氮生成增加；与空白对照组相比,AICAR组(312.57±20.61 umol/L)、Met组(263.57±46.11μmol/L)的培养液中一氧化氮生成增加,且均具有统计学意义(p<0.05)。2.一氧化氮合成酶生成量：与空白对照组(71.98±26.61μmol/L)相比,软脂酸组(46.57±27.42μmol/L)的培养液中内皮型一氧化氮合酶生成减少；与软脂酸组相比,AICAR+PA组(92.28±51.01μmol/L)、Met+PA组(69.11±14.96μmol/L)的培养液中内皮型一氧化氮合酶生成增加；与空白对照组相比,AICAR组(139.47±27.29μmol/L)、Met组(134.09±34.61μmol/L)的培养液中内皮型一氧化氮合酶生成增加,且均具有统计学意义(p<0.05)3. P-AMPK蛋白表达量：与空白对照组相比,软脂酸组的P-AMPK蛋白表达量低下；与软脂酸组相比,AICAR+PA组、Met+PA组的P-AMPK蛋白表达量增加；与空白对照组相比,AICAR组、Met组的P-AMPK蛋白表达量增加,且均具有统计学意义(p<0.05)4. eNOS蛋白表达量：与空白对照组相比,软脂酸组的eNOS蛋白表达量低下；与软脂酸组相比,AICAR+PA组、Met+PA组的eNOS蛋白表达量增加；与空白对照组相比,AICAR组、Met组的eNOS蛋白表达量增加,且均具有统计学意义(p<0.05)。结论二甲双胍能够使人血管内皮细胞AMPK激活,增加细胞内一氧化氮合酶和一氧化氮含量,可能是其改善血管内皮功能及抗血管内皮细胞损伤的机制,从而起到抗动脉粥样硬化的作用。

全文目录

摘要  4-8
Abstract  8-14
英文缩略词表  14-15
引言  15-18
材料与方法  18-29
实验结果  29-34
讨论  34-39
结论  39-40
参考文献  40-43
综述  43-64
  参考文献  57-64
致谢  64-65
个人简介  65

二甲双胍激活腺苷酸活化蛋白激酶途径改善内皮功能的研究

内容摘要

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