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免疫PCR检测低含量H5N1禽流感病毒方法的建立及初步应用

作　者: 邓明俊
导　师: 张彦明
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 免疫PCR H5N1禽流感病毒 H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白 检测
分类号: S855.3
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)是由正黏病毒科A型流感病毒中某些亚型引起的家禽和鸟类的高度致死性传染病。A型流感病毒的核衣壳和基质蛋白具有相似的抗原性,但根据血凝素(H)和神经氨酸酶(N)的抗原性的不同,可将其分成不同的亚型。至今,使鸡和火鸡发生的高致病性流感,其病原都是A型H5或H7亚型禽流感病毒,其中严重危害养禽业的禽流感病毒为H5N1亚型。对高致病性禽流感病毒的检测及确定性诊断,目前采用的方法主要还是病毒分离鉴定。然而,这一经典方法周期长,耗时费力,稍有不慎还会有引发禽流感病毒散播的可能性。RT-PCR是目前常用的禽流感快速诊断方法之一。然而,在禽感染发生的初期,棉拭子中的病毒含量不足,或病料、样品储存不当、运送时间过长,或RT-PCR技术环节操作不当、试验环境受到污染等情况时,都有可能导致RT-PCR检测结果呈现假阴性或假阳性,不适合在进出口检验检疫部门和基层兽医机构应用。免疫PCR是一种检测微量蛋白的高灵敏度技术。该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高敏感性有机的结合起来,是迄今最敏感的抗原检测方法之一,可有效解决禽流感病毒检测中经典方法和普通RT-PCR方法存在的弊端和不足。本研究分别以禽流感病毒(Avian influenza virus ,AIV)H5亚型血凝素蛋白和H5亚型禽流感病毒为研究对象,建立了四种免疫PCR检测技术,并研究和评价了该免疫PCR技术对禽流感病毒检测的效果和意义,获得了以下研究结果:(1)以TopYield 96孔板为固相免疫吸附载体,以禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白为检测对象,通过一系列免疫反应及亲和素-生物素桥联作用,将生物素标记的报告DNA分子和生物素标记的禽流感病毒H5亚型抗体分子连接。充分洗涤后,在TopYield板孔中添加PCR反应液,对报告DNA进行PCR扩增。通过优化报告DNA分子和链亲和素的浓度,两种免疫PCR方法可检测到1fg的禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白,与常规ELISA方法相比,灵敏度提高了近1000倍。(2)以H5N1亚型禽流感病毒为研究对象,金磁性微球为固相吸附载体,以5′端标记有生物素的引物PCR扩增(pUC19为模板),制备含有生物素的报告DNA分子。通过亲和素-生物素的桥联作用将含有生物素的报告DNA分子和生物素标记的H5亚型禽流感病毒抗体分子连接。免疫反应后,体外扩增报告DNA,间接放大检测信号,达到有效检出微量H5亚型禽流感病毒的目的。为了进一步验证该方法检测H5亚型禽流感病毒的特异性,本研究对新城疫病毒(NDV)、H7亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)H120株进行了检测。结果表明,通过优化报告DNA分子和链亲和素的浓度,建立的免疫PCR方法可成功检测到10-4 EID50 /mL的H5亚型禽流感病毒(H5N1)。(3)为了到达同时有效检出临床样本中低含量禽流感病毒和新城疫病毒的目标,本研究建立了一种以金磁微球为载体的双重免疫PCR技术,通过高特异性的抗原-抗体反应与高灵敏度的PCR技术相结合,显著放大微量病毒检测信号。以预先包被有捕获抗体的金磁性微球为固相载体,以H5N1 AIV和NDV为检测对象,通过生物素-亲和素系统将两种不同的报告DNA分别与抗AIV H5亚型血凝素蛋白的检测抗体和抗NDV F蛋白的检测抗体连接。充分洗涤后,将偶联在检测抗体上的报告DNA解链下来,通过一对相同的引物PCR扩增两种不同的报告DNA,间接放大病毒检测信号。结果显示,通过优化报告DNA和链亲和素的工作浓度,优化洗涤次数、PCR扩增循环数等条件,该免疫PCR技术可同时特异性的检测到30μL 10-4EID50/mL H5N1 AIV, 30μL 10-3EID50 /mL NDV,但对AIV H7亚型、AIV H9亚型、IBDV、IBV等病毒无非特异性反应。说明本研究建立的以金磁微球为固相吸附载体的双重免疫PCR技术是同时检测微量AIV和NDV的一种高灵敏度检测技术。(4)为了到达有效的检测出临床禽只鼻、喉棉拭子样本中低含量禽流感病毒的目标,本研究建立了一种改良的免疫PCR技术。本方法以H5N1 AIV为检测对象,将不同浓度的AIV包被在TopYield板中,以鼠抗AIV H5单抗为检测抗体,通过化学分子SMCC将检测抗体与含有限制性内切酶BamH I的报告DNA分子预先联接。通过限制性内切酶将已知DNA与抗原-抗体复合物分离,体外扩增DNA。与传统免疫PCR中通过亲和素和生物素的桥联作用将报告DNA分子和抗体分子连接相比较,本方法将报告DNA分子和抗体分子通过化学的方法直接连接,既简化了检测步骤,又降低了非特异性产生。结果显示,通过优化洗涤次数、扩增循环数等条件,改良的免疫PCR技术可检测到100μL 10-4EID50 /mL AIV,与常规ELISA方法相比,灵敏度提高了1000倍。与常规RT-PCR相比,灵敏度提高了100倍。本研究对H7亚型、H9亚型AIV病毒进行免疫PCR检测,结果表明对H5亚型以外的其他亚型AIV无特异性反应。因此,本试验建立的改良免疫PCR方法是一种灵敏度高、特异性好的微量AIV检测技术,非常适宜临床检测微量H5亚型禽流感病毒。综上所述,本研究结果显示,免疫PCR检测技术具有灵敏度高、特异性强等优点,它可以对活禽流感病毒(H5N1)和流感病毒蛋白(AIV H5亚型血凝素蛋白)直接进行检测,可作为大批量样本禽流感流行病学调查、禽流感疫情监控以及禽流感疾病诊断的备选方法。同时,该免疫PCR技术也为探索超微量病原微生物的有效检测方法奠定了基础。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-14
文献综述  14-37
  第一章 禽流感病毒分子生物学研究进展  14-23
    1.1 禽流感病毒基因编码蛋白的结构和功能  14-19
      1.1.1 血凝素（Hemagglutinin，HA）  14-17
      1.1.2 神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）  17-18
      1.1.3 核蛋白（Nucleoprotein，NP）  18
      1.1.4 基质蛋白（Matix proteins，M）  18-19
      1.1.5 聚合酶（Polymerase）  19
      1.1.6 非结构蛋白（Nonstructural protein，NS）  19
    1.2 禽流感致病性的分子生物学基础  19-23
      1.2.1 病毒与宿主细胞膜的融合  20
      1.2.2 病毒的复制和转录  20-21
      1.2.3 核的输出  21
      1.2.4 病毒在质膜上的组装  21
      1.2.5 病毒的出芽和释放  21-23
  第二章 禽流感病毒诊断技术研究进展  23-30
    2.1 病原分离鉴定  23-24
    2.2 血清学试验  24-26
      2.2.1 琼脂免疫扩散试验  24-25
      2.2.2 血凝试验和血凝抑制试验  25
      2.2.3 免疫荧光技术  25-26
      2.2.4 酶联免疫吸附试验  26
    2.3 分子生物学检测  26-28
      2.3.1 反转录聚合酶链式反应扩增技术（RT-PCR）  27
      2.3.2 实时定量PCR 技术（Real time RT-PCR，RRT-PCR）  27
      2.3.3 基因芯片分型技术  27-28
      2.3.4 依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）  28
      2.3.5 环介导的等温扩增技术（LAMP）  28
    2.4 小结  28-30
  第三章 免疫PCR 技术研究进展  30-37
    3.1 免疫PCR 体系  31-34
      3.1.1 免疫PCR 抗原-抗体反应系统  31-32
      3.1.2 免疫PCR 桥联系统  32
      3.1.3 免疫PCR 指示系统  32-33
      3.1.4 免疫PCR 检测系统  33-34
    3.2 免疫PCR 技术的拓展  34
      3.2.1 T7 RNA 聚合酶扩增免疫PCR 检测技术  34
      3.2.2 磁珠免疫PCR 技术  34
    3.3 免疫PCR 技术的应用  34-36
      3.3.1 肿瘤标记物检测  34-35
      3.3.2 可溶性细胞受体检测  35
      3.3.3 激素和细胞因子检测  35
      3.3.4 生化酶类的检测  35
      3.3.5 致病微生物检测  35
      3.3.6 寄生虫感染检测  35-36
    3.4 免疫 PCR 技术展望  36-37
试验研究  37-83
  第四章 微量禽流感病毒 H5 蛋白免疫PCR 检测方法的建立  37-50
    4.1 材料  37-38
      4.1.1 试剂  37-38
      4.1.2 主要仪器  38
    4.2 方法  38-41
      4.2.1 报告DNA 分子的制备  38
      4.2.2 间接ELISA 检测禽流感病毒H5 血凝素蛋白  38-39
      4.2.3 间接Sandwich ELISA 检测禽流感病毒H5 血凝素蛋白  39
      4.2.4 间接免疫PCR 方法检测禽流感病毒H5 血凝素蛋白  39-40
      4.2.5 间接Sandwich 免疫PCR 方法检测禽流感病毒 H5 血凝素蛋白  40-41
    4.3 结果  41-48
      4.3.1 间接ELISA 和间接Sandwich ELISA 试验中链亲和素浓度的优化和确定  41-43
      4.3.2 免疫PCR 中最佳报告DNA 浓度的确定  43-44
      4.3.3 免疫PCR 中最佳链亲和素浓度的确定  44-45
      4.3.4 间接ELISA 及Sandwich ELISA 检测禽流感病毒H5 血凝素蛋白的灵敏性试验  45-47
      4.3.5 间接免疫PCR 及间接Sandwich 免疫 PCR 方法检测 AIV H5 血凝素蛋白的灵敏性  47-48
      4.3.6 免疫PCR 与ELISA 方法检测病原的效果比较  48
    4.4 讨论  48-50
      4.4.1 报告DNA 的选择  48
      4.4.2 外界因素对免疫PCR 的影响  48-49
      4.4.3 免疫PCR 方法在微量禽流感病毒检测中的应用前景  49-50
  第五章 以金磁微球为固相吸附载体建立免疫PCR 技术检测H5N1 禽流感病毒  50-60
    5.1 材料  50-51
      5.1.1 试剂  50-51
      5.1.2 病毒  51
      5.1.3 主要仪器  51
    5.2 方法  51-54
      5.2.1 报告DNA 的制备  51
      5.2.2 抗体包被金磁微粒  51-52
      5.2.3 抗体的生物素标记  52-53
      5.2.4 病毒的准备和稀释  53
      5.2.5 免疫PCR 检测H5 亚型禽流感病毒（AIV/H5N1）  53
      5.2.6 免疫PCR 方法检测禽流感病毒的体系优化  53-54
      5.2.7 最适报告DNA 浓度的确定  54
      5.2.8 最适链亲和素浓度的选择  54
      5.2.9 免疫PCR 检测禽流感病毒的灵敏度  54
    5.3 结果  54-58
      5.3.1 金磁微球抗体包被效率评价  54-55
      5.3.2 生物素标记抗体结果  55
      5.3.3 最适报告DNA 浓度的确定  55-56
      5.3.4 最适链亲和素浓度的选择  56-57
      5.3.5 免疫PCR 检测AIV 的灵敏度  57
      5.3.6 免疫PCR 检测AIV 的特异性试验  57-58
    5.4 讨论  58-60
  第六章 双重免疫PCR 检测H5N1 禽流感病毒和新城疫病毒  60-73
    6.1 材料  61-62
      6.1.1 分子生物学材料  61
      6.1.2 金磁微粒  61
      6.1.3 免疫学试剂  61
      6.1.4 病毒  61-62
      6.1.5 主要仪器  62
    6.2 方法  62-65
      6.2.1 病毒的准备和稀释  62
      6.2.2 报告DNA 的制备（生物素标记DNA）  62
      6.2.3 捕获抗体包被金磁微球  62-63
      6.2.4 检测抗体的生物素标记  63
      6.2.5 免疫PCR 检测新城疫病毒和禽流感病毒  63-64
      6.2.6 报告DNA 和链亲和素最适工作浓度的优化和选择  64
      6.2.7 双重免疫PCR 方法检测AIV 和NDV  64
      6.2.8 双重免疫PCR 检测H5 亚型AIV 和NDV 的特异性试验  64-65
    6.3 结果  65-69
      6.3.1 金磁微球抗体包被效率评价  65
      6.3.2 抗体的生物素标记评价  65
      6.3.3 最适报告DNA 浓度的选择  65-67
      6.3.4 最适链亲和素浓度的选择  67-68
      6.3.5 免疫PCR 检测AIV 和NDV 的灵敏度  68-69
      6.3.6 复合免疫PCR检测AIV和NDV的特异性  69
    6.4 讨论  69-73
  第七章 改良免疫PCR 技术检测低浓度H5N1 禽流感病毒  73-83
    7.1 材料  73-74
      7.1.1 主要试剂  73-74
      7.1.2 化学试剂  74
      7.1.3 主要仪器  74
    7.2 方法  74-78
      7.2.1 免疫PCR 方法的建立  74-78
    7.3 结果  78-80
      7.3.1 Real time RT-PCR 检测 H5N1AIV 的灵敏度  78
      7.3.2 Sandwich ELISA 方法检测H5N1AIV 的灵敏度  78-79
      7.3.3 免疫PCR 方法检测H5N1AIV 的灵敏度  79-80
    7.4 讨论  80-83
      7.4.1 改良免疫PCR 方法的优点  80
      7.4.2 报告DNA 的选择  80-81
      7.4.3 外界因素对免疫PCR 的影响  81
      7.4.4 免疫PCR 方法在禽流感病毒微量检测中的应用前景  81-83
结论  83-84
参考文献  84-91
主要缩略词和中英文对照表（Abbreviation Index）  91-92
致谢  92-93
作者简介  93

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 病毒病
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