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猪血管内皮细胞microRNA库的建立及与猪瘟病毒感染相关microRNA的筛选

作　者: 张倩
导　师: 张彦明
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: microRNA 猪瘟病毒感染猪脐静脉血管内皮细胞
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

MicroRNA(miRNA)是近年发现的一类非编码调节性小分子RNA,其在病毒的感染过程中起着重要的调节作用。本研究旨在发现猪血管内皮细胞(SUVEC)中的microRNA,并筛选与猪瘟病毒感染相关的miRNA。(1)应用Illumina Solexa测序仪在猪血管内皮细胞中获得了18721836条35 nt以下的小分子RNA序列,通过去除低质量的以及接头序列,共获得了13612934条高质量的小RNA序列(clean reads),然后通过SOAP软件(Short oligonucleotide alignment program)将这些sRNA定位到基因组上,分析其在基因组上的分布和表达情况,结果中有8547658条序列(占总数的62.79%)比对上了猪的基因组。再通过NCBI GenBank和Rfam两个数据库以及重复序列、内含子和外显子进行比对,去除其中可能的rRNA、scRNA、tRNA、snRNA、snoRNA以及来自mRNA降解片段的sRNA,结果获得了5932143个miRNA,占总sRNA的43.58%。通过生物信息学分析,我们确定了154个miRNA基因编码116个成熟的保守miRNAs和66个miRNA*,同时发现了4个新的猪特有的miRNAs。(2)采用基因芯片技术确认了发现的miRNA的表达,并筛选出猪血管内皮细胞接种CSFV后有表达差异的miRNA,其中8条miRNAs的表达量上调,4条miRNAs的表达量下调。(3)应用生物学软件RNA22预测发现let-7家族能够与CSFV 3’UTR结合的miRNA ,并用含有CSFV3’非编码区片段的双荧光素酶报告基因载体验证,结果表明let-7a、let-7c和let-7i能够与CSFV 3’UTR结合。进一步证实let-7对猪瘟病毒的调节作用,分别将let-7家族的let-7a、let-7c和let-7i模拟物和抑制物转染到猪脐静脉血管内皮细胞中,然后接种CSFV,结果let-7a和let-7c模拟物能够抑制CSFV的增殖;接种CSFV后细胞中CSFV感染猪血管内皮细胞后核不均一蛋白A1(Nuclear ribonucleoproteins, hnRNP A1)表达量增加, let-7a表达量被下调。本研究结果揭示了猪血管内皮细胞中的miRNA在CSFV感染中的作用,为CSFV的分子致病机理提供了有价值的科学资料。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-12
文献综述  12-22
  第一章 microRNA 研究进展  12-18
    1.1 miRNA 基因组学  12-13
    1.2 miRNA 的生物起源  13
    1.3 miRNA 与siRNA 的区别  13-15
    1.4 miRNA 靶标预测的种子序列  15
    1.5 Supplement 和 Compensatory 位点  15-18
  第二章 miRNA 与病毒  18-22
    2.1 病毒miRNA 及其靶标  18
    2.2 细胞miRNA 及其病毒靶标  18
    2.3 病毒miRNA 的多种功能  18-20
    2.4 干扰宿主细胞的基因表达  20
    2.5 细胞miRNA 在病毒感染中的作用  20-22
      2.5.1 细胞miRNA 能够影响哺乳动物病毒的复制  20-21
      2.5.2 MiRNA 介导的抗病毒活性  21
      2.5.3 病毒对RNA 干扰的回应  21-22
试验研究  22-46
  第三章猪脐静脉血管内皮细胞microRNA 库的建立  22-30
    3.1 材料  22-23
      3.1.1 细胞  22
      3.1.2 细胞培养试剂及其配置  22-23
      3.1.3 主要试剂  23
      3.1.4 主要仪器设备  23
    3.2 方法与步骤  23-25
      3.2.1 细胞的准备  23
      3.2.2 细胞总RNA 的提取  23
      3.2.3 总RNA 的完整性鉴定  23-24
      3.2.4 Illumina Solexa 测序  24-25
    3.3 结果  25-28
      3.3.1 提取细胞总RNA 完整性鉴定  25
      3.3.2 测序分析结果  25-28
    3.4 讨论  28-29
    3.5 小结  29-30
  第四章猪瘟病毒相关的miRNA 的筛选  30-36
    4.1 材料  30
      4.1.1 细胞与病毒  30
      4.1.2 主要试剂  30
      4.1.3 仪器与设备  30
    4.2 方法与步骤  30-32
      4.2.1 病毒材料的准备  30-31
      4.2.2 样品的准备RNA  31
      4.2.3 荧光标记miRNA 的制备  31
      4.2.4 杂交反应  31-32
      4.2.5 数据采集与分析  32
    4.3 结果  32-34
      4.3.1 RNA 完整性鉴定  32-33
      4.3.2 芯片杂交图谱  33
      4.3.3 miRNA 差异表达分析  33-34
    4.4 讨论  34-35
    4.5 小结  35-36
  第五章 miRNA 在CSFV 感染中作用的研究  36-46
    5.1 材料  36
      5.1.1 质粒与菌株  36
      5.1.2 细胞与病毒  36
      5.1.3 主要试剂  36
      5.1.4 仪器与设备  36
    5.2 方法与步骤  36-39
      5.2.1 靶向CSFV RNA 基因组microRNA 的预测  36-37
      5.2.2 psiCHECK~(TM)-3′与合成的microRNA inhibitors 共转染SUVEC  37
      5.2.3 psiCHECK~(TM)-3′与合成的microRNA mimics 共转染SUVEC  37
      5.2.4 突变psiCHECK~(TM)-3 质粒分别与miRNA 的inhibitor 和mimics 共转染SUVEC  37
      5.2.5 microRNA inhibitors 转染猪瘟病毒感染的SUVEC  37-38
      5.2.6 microRNA mimics 转染猪瘟病毒感染的SUVEC  38
      5.2.7 猪瘟病毒感染SUVEC 后检测let-7a 和hnRNPA1 mRNA  38-39
    5.3 结果  39-44
      5.3.1 SUVEC 中miRNA 对猪瘟病毒作用的预测结果  39-40
      5.3.2 psiCHECK~(TM)-3′与合成的microRNA inhibitors 共转染SUVEC 荧光活性检测结果  40-41
      5.3.3 psiCHECK~(TM)-3′与合成的microRNA mimics 共转染SUVEC 荧光活性检测结果  41
      5.3.4 突变质粒分别同miRNA 的inhibitor 和mimics 共转染SUVEC 荧光活性检测结果  41-42
      5.3.5 microRNA mimics 转染猪瘟病毒感染的SUVEC 检测结果  42-43
      5.3.6 microRNA inhibitors 转染猪瘟病毒感染的SUVEC 检测结果  43
      5.3.7 荧光定量PCR 检测猪瘟病毒感染SUVEC 中hnRNP A1 m RNA 和let-7a 表达  43-44
    5.4 讨论  44-45
    5.5 小结  45-46
结论  46-47
参考文献  47-52
致谢  52-53
作者简介  53

猪血管内皮细胞microRNA库的建立及与猪瘟病毒感染相关microRNA的筛选

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