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三类天然化合物的抗癌活性机制研究

作　者: 王光辉
导　师: 姚新生；杨梦甦
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药物化学
关键词: 甾体皂苷类化合物 二苯乙烯类化合物 联苄类化合物 菲类化合物 甲基原薯蓣皂苷 PYB 抗肿瘤作用 细胞凋亡 细胞周期阻滞 细胞周期蛋白 微管蛋白 肿瘤侵袭
分类号: R91
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


肿瘤是严重威胁人类健康的主要疾病之一。据美国癌症协会2000年统计，每10万人中的死亡率，与1950年相比，心脑血管疾病和肺炎及一些感染性疾病都有很大的降低，唯独肿瘤的死亡率仍呈升高趋势，因此，寻找高效低毒的肿瘤治疗药物成为当前医药学界的首要任务。本文的主要目的是从三类天然化合物寻找低毒、选择性强、对肿瘤细胞具有良好抑制效果的化合物，并对其作用机理进行初步研究。首先，采用MTT法，利用NCI推荐的小三系细胞（NCI-H460、SF-268、MCF-7）以及人肝癌细胞（HepG2）、人肝癌耐药株细胞（R-HepG2）和人正常肝细胞（QSG-7701）作为筛选体系，对63种甾体皂苷类化合物进行了体外细胞毒的活性筛选，结果显示，化合物甲基原薯蓣皂苷（MPD）活性最好。MPD对5种肿瘤细胞均有良好的抑制作用，且对人正常肝细胞的毒性很小，其中对人肝癌细胞的半数抑制率达到7.5μm左右。在利用小鼠体内动物实验研究MPD对肉瘤S180和Luis肺癌的抑制作用时发现：MPD对肿瘤细胞的生长具有一定的抑制作用，抑制率在30％左右；在利用Luis肺癌探讨给药途径对药效所产生的不同作用时发现：尾静脉注射效果最好，抑制率在50％左右，灌胃给药具有一定效果，抑制率在30％左右，腹腔给药没有效果。在利用裸鼠对MPD的体内抗癌活性进行评价时，发现MPD对裸鼠移植人肝癌HepG2的抑制率在37％左右。在MPD体内动物实验研究有效的基础上，我们在细胞、分子水平上对MPD的作用机理进行了探讨，结果发现：MPD可能通过上调肿瘤抑制因子p53基因的表达量而上调了细胞周期抑制蛋白p21基因的表达，从而抑制了细胞周期蛋白Cyclin B1的表达使p34cdc-2蛋白被激活的量降低，最终将人肝癌细胞HepG2阻滞在G2/M期；与此同时上调了细胞凋亡促进蛋白Bax的表达量以及降低细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达量而导致HepG2细胞发生凋亡，这些蛋白、基因的表达都具有良好的时效、量效关系。另外MPD对微管蛋白聚合的抑制作用也有可能是MPD将肝癌细胞阻滞在G2/M期的因素之一。在利用人高密度基因芯片对MPD的抗癌作用进行检测时发现：MPD对多种与细胞周期、凋亡、分化相关的基因具有调节作用，其更加深入的作用机理和途径有待于继续研究探讨。通过MTT法从23种二苯乙烯及联苄类化合物中筛选得到具有良好活性的白藜芦醇类似物PYB。对PYB进行深入研究的结果表明：其作用机理与白藜芦醇相似，即通过上调细胞周期蛋白Cyclin B1的表达量，将细胞阻滞在G2/M期；通过上调Bax的表达量以及裂解caspase-3的作用底物PARP诱导细胞发生凋亡。另外，通过侵袭小室模型确认了PYB对人高转移肝癌FHCC-98细胞在体外的侵袭具有良好的抑制作用。采用类似的方法对22种菲类化合物进行了抗癌活性的筛选，并对其中活性最好的4，5-二羟基-2-甲氧基-9，10-二氢菲进行了抗癌机理的初步研究，结果表明其通过下调细胞周期蛋白Cyclin B1的表达量而将细胞阻滞在G2/M期，其对凋亡的作用并不明显。综上所述，本文对三类天然产物在抗癌方面的作用机理进行了较为系统的研究，在对甾体皂苷类化合物的研究中发现，MPD不仅在体外和体内实验中显示了很好的抗癌效果，而且毒性很低，因此有可能成为新型的抗癌药物或者保健药品；在对二苯乙烯和联苄类化合物的研究中发现了体外抗癌活性比白藜芦醇更强的化合物PYB，提示其具有一定的开发前景；对菲类化合物中活性较好化合物的抗癌机理研究，填补了本类化合物在抗癌机理研究方面的空白，为拓宽菲类化合物的日后应用提出了可能。对这三类天然产物抗癌机理的研究，为将来新型抗癌药物的开发奠定了基础，为其在治疗癌症方面的应用提供了的理论依据。

全文目录


摘要  11-13
ABSTRACT  13-15
第一章 前言  15-29
  1.1 抗肿瘤药物的研究现状  15-16
  1.2 细胞凋亡的分子机制及植物来源的凋亡促进剂  16-22
  1.3 细胞周期的调控机制及植物来源的细胞周期抑制剂  22-25
  1.4 肿瘤转移的研究现状  25-29
第二章 甾体皂苷类化合物的抗癌活性机理研究  29-80
  第一节 甾体皂苷类化合物的体外活性筛选  30-49
    2.1.1 实验材料与方法  31-34
      2.1.1.1 细胞株  31
      2.1.1.2 试剂与仪器  31-32
      2.1.1.3 细胞培养  32
      2.1.1.4 MTT比色法  32-34
    2.1.2 供试甾体皂苷类化合物的结构信息及肿瘤细胞毒活性筛选结果  34-49
    2.1.3 结果评价  49
  第二节 Methyl protodioscin(MPD)抗癌作用机理的深入研究  49-75
    2.2.1 MPD的体内抑瘤实验  49-54
      2.2.1.1 MPD对小鼠肉瘤S180的抑制作用  49-51
      2.2.1.2 MPD对Luis肺癌的抑制作用  51-53
      2.2.1.3 MPD对裸鼠移植人肝癌HepG2的抑制作用初步研究  53-54
    2.2.2 MPD对人肝癌细胞HepG2的作用机制研究  54-75
      2.2.2.1 MPD对HepG2细胞的周期阻滞作用及周期调控相关蛋白的影响  54-62
        2.2.2.1.1 细胞周期检测方法  54-55
        2.2.2.1.2 蛋白质印迹法  55-59
        2.2.2.1.3 微管蛋白聚集抑制活性  59-60
        2.2.2.1.4 实验结果  60-62
          2.2.2.1.4.1 MPD对HepG2细胞株的细胞周期影响  60-61
          2.2.2.1.4.2 蛋白质印迹法检测细胞周期相关蛋白Cyclin B1、p34~(cdc-2)蛋白表达量的变化  61-62
          2.2.2.1.4.3 MPD对微管蛋白聚集的抑制活性  62
      2.2.2.2 MPD对HepG2细胞的凋亡诱导作用  62-66
        2.2.2.2.1 实验材料和方法  62-63
          2.2.2.2.1.1 Hoechst 33528染色  62-63
          2.2.2.2.1.2 检测细胞凋亡情况的Annexin V-FITC/PI双染法  63
          2.2.2.2.1.3 蛋白质印迹法  63
        2.2.2.2.2 实验结果  63-66
          2.2.2.2.2.1 MPD导致HepG2细胞的形态变化  63-64
          2.2.2.2.2.2 MPD诱导HepG2细胞的染色质凝集  64
          2.2.2.2.2.3 AnnexinV-FITC/PI双染法检测MPD诱导HepG2细胞凋亡的影响  64-65
          2.2.2.2.2.4 MPD对凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达量的影响  65-66
      2.2.2.3 MPD对HepG2细胞中p21和p53基因表达的影响  66-70
      2.2.2.4 利用基因芯片检测MPD对HepG2细胞中基因表达的影响  70-75
  第三节 小结与讨论  75-80
第三章 二苯乙烯类及菲类化合物的抗癌活性机理研究  80-102
  一、二苯乙烯类化合物的抗癌活性机理研究  80-92
    第一节 二苯乙烯及联苄类化合物的体外细胞毒活性筛选  80-85
      3.1.1.1 实验材料与方法  80-81
      3.1.1.2 供试二苯乙烯及联苄类化合物的结构信息及肿瘤细胞毒活性筛选结果  81-84
      3.1.1.3 结果评价  84-85
    第二节 PYB的深入研究  85-91
      3.1.2.1 PYB对人肝癌细胞HepG2的作用机制研究  85-91
        3.1.2.2.1 PYB对HepG2细胞的周期阻滞作用及周期相关蛋白的影响  85-86
          3.1.2.2.1.1 细胞周期检测方法  85
          3.1.2.2.1.2 蛋白质印迹法  85
          3.1.2.2.1.3 实验结果  85-86
            3.1.2.2.1.3.1 PYB对HepG2细胞株的细胞周期影响  85-86
            3.1.2.2.1.3.2 蛋白质印迹法检测细胞周期相关蛋白Cyclin B1、p34~(cdc-2)蛋白表达量的变化  86
        3.1.2.2.2 PYB对HepG2细胞的凋亡诱导作用  86-87
          3.1.2.2.2.1 实验材料和方法  86
          3.1.2.2.2.2 实验结果  86-87
            3.1.2.2.2.2.1 PYB导致HepG2细胞的形态变化  86-87
            3.1.2.2.2.2.2 PYB诱导HepG2细胞的染色质凝集  87
            3.1.2.2.2.2.3 PYB对凋亡相关蛋白PARP和Bcl-2表达量的影响  87
        3.1.2.2.3 PYB抑制人高转移肝癌FHCC-98细胞转移的作用  87-91
          3.1.2.2.3.1 PYB对FHCC-98细胞生长的影响  87
          3.1.2.2.3.2 PYB对FHCC-98细胞在体外粘附的抑制作用  87
          3.1.2.2.3.3 PYB对FHCC-98细胞侵袭力的影响  87-91
    第三节 小结与讨论  91-92
  二、菲类化合物的抗癌活性机理初步研究  92-102
    第一节 菲类化合物的体外细胞毒活性筛选  92-97
      3.2.1.1 实验材料与方法  92
      3.2.1.2 供试菲类化合物的结构信息及肿瘤细胞毒活性筛选结果  92-97
      3.2.1.3 结果评价  97
    第二节 4,5-二羟基-2-甲氧基-9,10-二氢菲抗癌机理的初步研究  97-98
      3.2.2.1 4,5-二羟基-2-甲氧基-9,10-二氢菲对HepG2细胞的周期阻滞作用及周期相关蛋白的影响  97-98
        3.2.2.1.1 细胞周期检测方法  97
        3.2.2.1.2 蛋白质印迹法  97
        3.2.2.1.3 实验结果  97-98
          3.2.2.1.3.1 4,5-二羟基-2-甲氧基-9,10-二氢菲对HepG2细胞株的细胞周期影响  97-98
          3.2.2.1.3.2 蛋白质印迹法检测细胞周期相关蛋白Cyclin B1、p34~(cdc-2)蛋白表达量的变化  98
    第三节 小结与讨论  98-102
第四章 总结与讨论  102-107
  4.1 总结  102
  4.2 讨论  102-107
参考文献  107-114
致谢  114-115
附录  115-123
  1.个人简历  115
  2.科研成果  115-117
  3.附图  117-123

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学
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