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海南霉素对瘤胃发酵模式、甲烷生成和微生物区系的影响

作　者: 刘薇
导　师: 张永根
学　校: 东北农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 海南霉素发酵模式甲烷微生物区系
分类号: S816
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本试验采用体外人工瘤胃发酵法研究日粮中添加不同水平的海南霉素对瘤胃发酵参数、甲烷生成、微生物区系和多样性变化的影响。旨在探讨海南霉素这一离子载体型抗生素是否可有效调控甲烷气体的生成、改变瘤胃发酵的类型以及对瘤胃微生物区系的影响。结果表明,日粮中添加海南霉素显著降低了瘤胃发酵的产气量(P<0.05),在体外发酵的各个时间点,海南霉素的不同添加水平以及莫能菌素组的产气量都显著低于对照组(P<0.05),且10mg/kg试验组的产气量显著低于其它水平(P<0.05)。在体外发酵的24h时间点,瘤胃发酵的产气量随海南霉素添加量的增加呈二次曲线规律下降(P<0.05)。由此可以表明,海南霉素可以抑制产气微生物的活性,且10mg/kg对产气量的抑制作用明显。海南霉素的添加降低了甲烷的产量(P<0.05),并随其添加量的增加呈明显的二次曲线规律下降(P<0.05),同时随着培养时间的增加,海南霉素对甲烷生成的抑制作用逐渐增强。当海南霉素的添加水平为7.2mg/kg时,其对甲烷的抑制能力最强。在体外发酵的过程中,海南霉素的各试验组以及莫能菌素组的pH值都显著高于对照组(P<0.05),说明海南霉素可以提高瘤胃液中的pH值。在体外发酵的24h时间点,随着添加水平的增加,瘤胃pH值呈显著的线性升高趋势(P<0.05),与对照组相比,10mg/kg的海南霉素可将pH值提高了4个百分点。日粮中添加海南霉素显著降低了氨态氮的浓度(P<0.05)。在24h发酵时间点,瘤胃氨态氮的浓度随海南霉素添加水平的提高呈二次曲线规律下降(P<0.05),各试验组比对照组氨氮浓度分别减少了6.45%、12.03%、12.21%。海南霉素的各试验组对瘤胃液中的总挥发性脂肪酸的影响不显著(P>0.05)。而乙、丁酸的摩尔比例及乙酸/丙酸值呈显著的下降趋势(P<0.05),丙酸的摩尔比例增加(P<0.05)。海南霉素可以降低体外瘤胃发酵过程中乙酸的含量,提高丙酸的浓度,从而改变了瘤胃的发酵类型。在日粮中添加不同水平的海南霉素,显著影响了发酵液中黄色瘤胃球菌,真菌及原虫的相对于总菌(16SrDNA)的数量(P<0.05),其中黄色瘤胃球菌以及真菌的数量随海南霉素添加量的提高呈二次曲线规律降低(P<0.05),而原虫的数量呈显著的线性降低(P<0.05)。而对于白色瘤胃球菌以及甲烷菌来说,海南霉素的添加水平对其影响均不显著(P>0.05)。日粮中添加海南霉素使细菌的种群及特异性发生了很大的变化。随着培养时间的延长样品DGGE图谱的条带数存在一定变化,条带6在海南霉素试验组与对照组中一直存在。添加海南霉素后,条带5代表的细菌处于优势位置。条带4代表的菌种经体外培养,对照组在16h后消失,海南霉素组在12h后则处于优势位置。在体外培养的12h时间点以后,条带3代表的菌种消失,而对照组中该细菌未消失。同时条带1与条带2在培养12h后则失去优势位置。对回收测序的优势条带比对分析后发现,其中条带1代表的菌在基因库中比对,其属于亨氏丁酸弧菌属(Butyrivibrio hungatei)。条带2、4、5代表的菌种属于未培养细菌(Uncultured rumen bacterium)。条带6代表菌为嗜淀粉瘤胃杆菌(Ruminobacter amylophilus),海南霉素的添加使条带3代表的细菌受到抑制,条带3代表的菌在基因库中登录为溶纤维丁酸弧菌(B.fibrisolvens)。由DGGE图谱的相似性分析可知,发酵各时间点瘤胃液样品的微生物区系相似性指数在62%-94%。总体上,海南霉素处理组单独形成簇Ⅰ,对照组形成簇Ⅱ。由此得出结论,日粮中添加海南霉素改变了瘤胃的发酵模式,抑制了甲烷产生,并显著影响了瘤胃微生物区系的组成。

全文目录

摘要  8-10
英文摘要  10-12
1 前言  12-26
  1.1 瘤胃内甲烷的生成  12-13
    1.1.1 甲烷生成的生化机制  12-13
    1.1.2 瘤胃内生成甲烷的机制  13
  1.2 瘤胃微生物调控甲烷的生成  13-17
    1.2.1 瘤胃产甲烷菌及其功能  13-14
    1.2.2 瘤胃甲烷生成相关菌种类及其功能  14-15
    1.2.3 甲烷生成相关菌相互的作用关系  15-17
  1.3 瘤胃内甲烷生成的调控  17-20
    1.3.1 瘤胃甲烷生成调控的进展  17
    1.3.2 影响甲烷生成的因素  17-19
    1.3.3 降低甲烷生成的措施  19-20
  1.4 离子载体调控瘤胃甲烷生成的研究进展  20-23
    1.4.1 离子载体的种类  21
    1.4.2 离子载体抑制甲烷生成的原理  21
    1.4.3 离子载体对瘤胃发酵的影响  21-22
    1.4.4 离子载体对瘤胃微生物的影响  22
    1.4.5 海南霉素的科学背景及进展  22-23
  1.5 瘤胃微生物的分子生物学研究  23-25
    1.5.1 瘤胃微生物基于rDNA/ rRNA 的分子生物学研究  23-24
    1.5.2 微生物的分子生物学定量方法  24-25
  1.6 本研究的目标和内容  25-26
2 材料与方法  26-36
  2.1 日粮中添加海南霉素对瘤胃微生物发酵的影响  26-28
    2.1.1 试验设计  26
    2.1.2 试验动物及瘤胃液采集  26
    2.1.3 体外培养液的组成  26-27
    2.1.4 体外培养装置  27
    2.1.5 测定指标与方法  27-28
  2.2 Real-timePCR 方法研究添加海南霉素对瘤胃微生态的影响  28-32
    2.2.1 试验设计  28
    2.2.2 试剂与仪器  28-29
    2.2.3 缓冲液与常用试剂的配制  29
    2.2.4 瘤胃微生物总DNA 的提取方法  29-30
    2.2.5 DNA 浓度和质量的检测  30
    2.2.6 引物的设计与合成  30-31
    2.2.7 Real-time PCR 的反应条件  31-32
    2.2.8 数据计算与统计分析  32
  2.3 DGGE 电泳研究日粮中添加海南霉素对瘤胃微生物区系的影响  32-35
    2.3.1 试验设计  32
    2.3.2 试剂与仪器  32
    2.3.3 DGGE 电泳试剂配制  32-33
    2.3.4 DGGE 电泳引物和反应条件  33
    2.3.5 DGGE 电泳试验方法  33-34
    2.3.6 DNA 片段的克隆测序及DGGE 图谱部分优势条带序列比对分析  34-35
  2.4 统计分析方法  35-36
3 结果与分析  36-54
  3.1 添加不同水平的海南霉素对瘤胃发酵参数的影响  36-45
    3.1.1 对瘤胃发酵产气量的影响  36-37
    3.1.2 对瘤胃发酵甲烷产量的影响  37-39
    3.1.3 对瘤胃发酵pH 值的影响  39-40
    3.1.4 对瘤胃发酵氨态氮含量的影响  40-41
    3.1.5 对瘤胃发酵挥发性脂肪酸的影响  41-45
  3.2 添加不同水平的海南霉素对瘤胃微生物区系的影响  45-49
    3.2.1 瘤胃微生物DNA 的提取  45-46
    3.2.2 瘤胃微生物的Real-time PCR 定量分析  46-49
  3.3 添加海南霉素对瘤胃微生物多样性的影响  49-54
    3.3.1 瘤胃细菌16SrDNA 的V6-V8 区PCR 扩增结果  49-50
    3.3.2 添加海南霉素对DGGE 图谱条带的影响  50
    3.3.3 DNA 条带的测序结果  50-52
    3.3.4 部分细菌优势条带的序列比对分析结果  52-53
    3.3.5 添加海南霉素对瘤胃微生物相似性指数的影响  53-54
4 讨论  54-59
  4.1 日粮中添加不同水平的海南霉素对瘤胃发酵参数的影响  54-55
  4.2 日粮中添加不同水平的海南霉素对甲烷生成的影响  55-56
  4.3 日粮中添加不同水平的海南霉素对瘤胃微生物生态区系的影响  56-57
  4.4 日粮中添加海南霉素对瘤胃微生物多样性的影响  57-59
5 结论  59-60
致谢  60-61
参考文献  61-68
攻读硕士学位期间发表的学术论文  68

海南霉素对瘤胃发酵模式、甲烷生成和微生物区系的影响

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