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磷酸萘酚喹抗药性机制的研究

作　者: 王红
导　师: 曹务春；王京燕
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 流行病与卫生统计学
关键词: 伯氏疟原虫磷酸萘酚喹抗性机制基因打靶
分类号: R531.3
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

疟疾是世界上发病率和死亡率最高的虫媒传染病之一。在四种寄生于人体的疟原虫中,恶性疟原虫感染人导致的恶性疟症状最为严重,死亡率也最高。自恶性疟原虫对氯喹产生抗药性以来,疟原虫的抗药性不断蔓延,抗性程度不断增强,在某些地区甚至出现了多药抗性、交叉抗性,使疟疾防治面临严峻困难,甚至影响了新药的使用。美军从1963-1974年用12年时间从25万个化合物中筛选出26个较有希望的新化合物进入临床研究,其中只有4--喹啉甲醇类中的甲氟喹被美军作为王牌药推向市场,但甲氟喹上市仅半年在泰国就报道出现抗性。对此,国内外学者对抗疟药抗性机制展开了大量研究。但目前唯一能确定抗性机制的仅有抗叶酸药,认为恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(Dihyrofolateredctase, DHFR)基因的突变导致了这类药物抗性的产生,而其他常用抗疟药如氯喹等喹啉类抗疟药的抗性机制目前仍未明确。磷酸萘酚喹是我所研制的I类抗疟新药,与氯喹同属4-氨基喹啉类抗疟药。动物实验显示,磷酸萘酚喹具有很高的抗疟活性。临床实验显示磷酸萘酚喹消除半衰期长达255h以上。长半衰期药物的优点是临床用药疗程短、依从性好,缺点是由于血液中较长时间存在低浓度药物,故与短半衰期药物相比容易产生抗性。因此,为保护新药,更合理地使用新药,延长新药的使用寿命,有必要对我国研制的抗疟新药磷酸萘酚喹抗性产生的情况及其抗性机制进行了解和研究。目前国内外均未见有关磷酸萘酚喹抗性机制的报道,但对氯喹的抗性机制已有大量的研究报道。研究普遍认为恶性疟原虫多药抗性基因1(Plasmodium falciparum multidrug resistance gene1, pfmdr1)、cg2和恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白(Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter, pfcrt)基因与氯喹抗性有关,其中研究的热点是crt基因,认为crt突变是氯喹抗性产生的关键。因此,本实验从crt基因入手,利用基因打靶技术展开磷酸萘酚喹抗性机制的研究。对基因功能研究最直接有效的办法就是进行等位基因替换,目前在疟原虫体内进行的等位基因替换实验大多是通过基因转染技术完成的。pPyrFlu是伯氏疟原虫转染的有效介质,将质粒载体与crt基因构建得到CRT targeting重组质粒,通过基因转染技术,利用质粒可进行的单交换机制,将敏感株和抗性株的crt等位基因进行替换来研究crt基因与磷酸萘酚喹抗性的关系。方法：(1)首先建立磷酸萘酚喹抗性株模型。在鼠疟动物模型上采用小剂量递增(ST)法培育磷酸萘酚喹抗性株,经4日抑制实验法测定ED50、ED90和抗性指数I50、I90；停药体内血传10代及冷冻保存12个月检测该抗性株抗性是否稳定；测定交叉抗性,评价该抗性株对青蒿素、氯喹、本芴醇和乙胺嘧啶等的药物敏感性；(2)参考伯氏疟原虫ANKA株的crt基因设计反转录及PCR引物,获得K173株、NQR株、CQR株的crt基因,分析所得目的基因与其它疟原虫crt基因和蛋白的同源性并比较磷酸萘酚喹抗性株crt基因与K173株、CQR株crt基因之间的差别；(3)构建CRT突变重组株并对其抗性表型进行鉴定。首先是crt Targetting质粒的构建,将K173株或抗性株的crt基因片段克隆到伯氏疟原虫转染质粒pPyrFlu中,获得以单交换机制整合的重组质粒PyrFlu/Pbcrt,经双酶切及PCR鉴定；其次是转染条件的优化,通过重组质粒线性化,伯氏疟原虫体外培养和设定不同的电转体系选择最优的转染条件；再次是乙胺嘧啶药物筛选及荧光显微镜下观察获得阳性转化子并做PCR鉴定；最后,测定重组K173-NQR/CQR株、NQR-K173株和CQR-K173株对磷酸萘酚喹、氯喹的敏感性分析重组株抗性表型的变化。结果：(1)在磷酸萘酚喹的持续压力下血传100代,历时23个月培育得到了伯氏疟原虫磷酸萘酚喹高度抗性株NQR,经测定EDs0、ED90分别为41.25mg/kg和152.23mg/kg,抗性指数I50和I90分别为105.8和200.3,均达到高度抗性；经停药血传10代和冷冻保存12个月测定,其抗性指数仍然保持200以上,未发生明显变化,说明其抗性程度比较稳定；交叉抗性实验中发现该抗性株对青蒿素、本芴醇和乙胺嘧啶具有中度交叉抗性,而与氯喹具有高度交叉抗性(I90=14.5)；(2)经RT-PCR首次扩增得到了伯氏疟原虫K173株的crt基因编码序列,经序列测定目的基因长1278bp,编码426个氨基酸,具有10个跨膜结构的膜转运蛋白；经比对该序列与其它疟原虫的crt基因和蛋白具有很高的同源性；序列比对发现NQR株目的基因全长1275bp,编码425个氨基酸,与K173株相比,NQR株crt基因存在41个碱基突变及3个碱基缺失,其中有意义的氨基酸突变有11个；NQR株、CQR株的crt基因序列相同；(3)得到以单交换机制获得整合的重组质粒PyrFlu/Pbcrt,经双酶切及PCR鉴定,证明目的基因crt已整合到载体中；体外培养伯氏疟原虫同步化于成熟裂殖体期的优化条件为20%胎牛血清的1640培养基,细胞压积比1%,在37℃蜡烛缸中培养18-22h；分别采用梯度密度离心法和磁珠分选法富集成熟裂殖体,比较富集得到的裂殖体比例及裂殖体活性,发现两种方法所获裂殖体质量均较好,无较大差别,只是操作时间上存在差别,梯度密度离心法富集裂殖体需要30min而磁珠分选法需要2h以上；选择100-400ul不同的电转体系,1.1kv,25uF,电阻无穷大的条件下进行电转化,只在300ul电转体系中获得了阳性转化子；经2轮乙胺嘧啶筛选后的阳性转化子在荧光显微镜下发出绿色荧光,经PCR鉴定也扩增得到了2kb的预期片段,说明重组质粒已正确地整合在伯氏疟原虫基因组中并进行了表达；(4)经测定,重组K173-NQR/CQR株的药物敏感性显著下降,对磷酸萘酚喹、氯喹的ED90分别为36.06±2.79mg/kg和93.70±8.83mg/kg,抗性表型I90分别为60.1和44.2;而重组NQR-K173株对磷酸萘酚喹、氯喹的敏感性则显著提高,ED90分别为2.76±0.79mg/kg和6.92±1.07mg/kg,I90分别为4.6和11.5；重组CQR-K173株对磷酸萘酚喹、氯喹的敏感性也显著提高,ED90分别为4.66±1.32mg/kg和19.08±3.39mg/kg,I90分别为2.2和9.0。结论：(1)通过ST法培育得到稳定的磷酸萘酚喹抗性株,实验显示磷酸萘酚喹在鼠疟模型上很容易产生抗性,且抗性程度高而强。因此,对其抗性机制的研究很有必要。研究证实,该抗性株对氯喹具有高度交叉抗性,提示我们在氯喹抗性区使用磷酸萘酚喹时要提高警惕,避免抗性程度的交叉累积。本研究提示,磷酸萘酚喹的抗性机制与氯喹有相同之处但不完全相同；(2)首次获得伯氏疟原虫K173株的crt基因；分析结果说明该基因突变很有可能与NQR抗性产生有关,且该基因与磷酸萘酚喹抗性产生的关系与氯喹抗性产生类似；(3)建立了伯氏疟原虫基因打靶技术,并运用此技术获得了表达NQR株crt基因、CQR株crt基因的重组伯氏疟原虫K173株和表达K173株crt基因的重组伯氏疟原虫NQR株、CQR株；(4)通过测定重组株的抗性表型,重组伯氏疟原虫K173对药物敏感性显著降低及重组伯氏疟原虫抗性株对药物敏感性显著增高充分说明crt基因在磷酸萘酚喹抗性产生过程中的关键作用；(5)除crt基因,可能还有其它因素共同决定了磷酸萘酚喹抗性的产生。有关磷酸萘酚喹的抗性机制还有待进一步深入研究。

全文目录

缩略词表  6-9
中文摘要  9-12
英文摘要  12-16
前言  16-20
第一部分伯氏疟原虫K173株磷酸萘酚喹抗性系的培育  20-29
  一. 材料与方法  20-23
    (一) 实验材料  20-21
    (二) 实验方法  21-23
      1 Plasmodium berghei Keyberg 173 strain的复苏、传代  21-22
      2 药物的配制  22
      3 磷酸萘酚喹抗性系的培育  22-23
  二. 实验结果  23-26
  三. 结果讨论  26-29
第二部分 CRT全长cDNA的克隆、鉴定及分析  29-48
  一. 材料与方法  29-38
    (一) 实验材料  29-33
    (二) 实验方法  33-38
      1 CRT全长cDNA的克隆  33-38
      2 CRT序列分析  38
  二. 实验结果  38-46
  三. 结果讨论  46-48
第三部分 CRT突变重组株的构建及抗性表型的鉴定  48-78
  一. 材料与方法  48-60
    (一) 实验材料  48-51
    (二) 实验方法  51-60
      1 CRT Targeting质粒的构建  51-53
      2 转染条件的优化  53-57
      3 重组克隆的筛选及鉴定  57-58
      4 伯氏疟原虫的保种和接种  58
      5 PCR检验伯氏疟原虫转化子  58-59
      6 有限稀释法克隆伯氏疟原虫转化子  59
      7 RT-PCR鉴定插入片段  59-60
      8 重组株抗性表型的鉴定  60
  二. 实验结果  60-74
  三. 结果讨论  74-78
结论  78-79
参考文献  79-87
附录  87-90
综述  90-97
论文  97-109
个人简历  109-110
致谢  110-111

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