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镉胁迫下水稻和油菜中microRNA的克隆、鉴定与miR395功能分析

作　者: 黄思齐
导　师: 杨志敏
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 镉(Cd) microRNA 水稻 缺硫 甘蓝型油菜 miR395 拟南芥
分类号: S565.4
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


microRNA (miRNA)是生物体内一类调控基因转录后表达的非编码的小分子RNAs (small RNA, sRNA).迄今为止,人们通过生物信息学和实验方法分离和鉴定到了大量的miRNA,并登录在miRNA数据库中(http://www.sanger.ac.uk/)。镉已经成为我国农田中有毒重金属污染的主要来源之一,它在植物中积累会破坏细胞功能,影响植物生长和发育。植物对重金属胁迫有不同的响应,其中很显著的就是,植物根系硫同化以及与谷胱甘肽代谢相关的基因表达上调。最近,越来越多的研究揭示了一些miRNA在各种非生物胁迫(如干旱、低温和机械力等)中的调控机制,然而对于不同物种中响应重金属胁迫的miRNA的研究甚少。水稻(Oryza sativa)是世界一种非常重要的粮食作物,而且水稻的全基因组测序已经完成,这为我们挖掘到更多的与重金属胁迫相关的miRNA提供了基础。为了获得新的响应胁迫的miRNA,我们构建了一个经80μM CdCl2处理的水稻(日本晴)sRNA文库。在文库中一共克隆到19个新的miRNA,均属于水稻特有的miRNA,分属于6个不同的家族。我们还克隆到10个水稻已知的miRNA,其中9个为植物中保守序列,另1个属于水稻特有的miRNA。另外,在此文库中我们还发现56个不同的其它内源性非编码sRNA。对新发现miRNA进行了靶基因的预测后,得到了34个潜在的基因。进一步检测这6个新发现的miRNA家族和10个已知的miRNA在镉、铜、铝胁迫下的表达,发现他们有不同的表达模式。其中,miR602与其靶基因木葡聚糖内酰基转移酶(xyloglucan endotransglycosylase, XET)以及miR604与其靶基因脂质转运蛋白(lipid transfer protein, LTP)都存在负调控关系。这些功能有待于做进一步的鉴定。油菜(Brassica napus)是世界第三大的油料作物。我们在油菜缺硫与重金属镉胁迫文库中克隆到5个新的保守miRNA,同时还克隆到2个与miR395相关的硫代谢响应基因BnAPS3 (FJ626851)和BnAPS4 (FJ626850).通过生物信息学和5’RACE实验方法确认了4个miR395的靶基因：BnSultr2;1,BnAPS1, BnAPS3和BnAPS4。此外,分析了miR395与其靶基因在缺硫胁迫和镉胁迫下的表达模式。镉胁迫和缺硫胁迫均能诱导miR395表达量增加,但其4个靶基因表现出不同的表达模式。将拟南芥395d前体转入到油菜之中,发现靶基因表达被抑制,其表皮毛缺失和发育延时等表型变化。目前研究发现拟南芥中有6个miR395的位点,调控4个不同的与硫代谢相关的靶基因。为了深入研究miR395调控功能,我们构建了拟南芥miR395c和miR395e前体的过表达植株,再利用Slim突变体和Mimic395转基因植株分析了它们在正常和缺硫胁迫下的调控模式。在硫胁迫下,miR395表达量增加,ATPS1表达基本不变,ATPS4表达显著下调,SULTR2；1表达上升。相对于野生型Col-0,miR395过表达植株的靶基因表达量明显下降,而Mimic395转基因植株在两种条件下的表达均有所增加。为了揭示在缺硫胁迫下,SULTR2;1的表达与miR395表达同时增加的非负调控现象,我们构建了将SULTR2;1基因与其自身启动子和GFP蛋白融合(SULTR2;1PRO::SULTR2;1:GFP)的转基因植株。此外,我们还构建了SULTR2；1与miR395互补位点点突变的植株(SULTR2;1PRO::SULTR2;1mutant:GFP),通过检测这两种不同的转基因株系GFP荧光强度,表明miR395起到了抑制SULTR2；1过量表达的作用。

全文目录


摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
缩略词表  13-14
文献综述  14-37
  1 植物microRNA  14-28
    1.1 植物miRNA的生物合成  14-17
      1.1.1 植物miRNA生物合成步骤  14-15
      1.1.2 miRNA合成过程中的关键蛋白  15-17
    1.2 植物中其它小分子RNA  17-19
      1.2.1 TasiRNA  17
      1.2.2 Nat-siRNA  17-18
      1.2.3 LsiRNA  18
      1.2.4 Nat-miRNA  18-19
      1.2.5 Hc-siRNA  19
    1.3 植物miRNA的功能  19-28
      1.3.1 调控植物发育  19-21
      1.3.2 miRNA在胁迫下的调控作用  21-24
      1.3.3 营养元素平衡  24-26
      1.3.4 胁迫响应miRNA是如何调控的  26-27
      1.3.5 发育因素和胁迫因子对miRNA的共调节  27-28
  2 镉对植物的生物学毒性  28-32
    2.1 镉对植物的毒害作用  28-30
      2.1.1 对光合作用的影响  28
      2.1.2 对营养元素吸收的影响  28
      2.1.3 胁迫导致植物自由基的过氧化损伤  28-30
    2.2 植物对镉毒害的耐性机理  30-32
      2.2.1 基因表达模式的改变  30-31
      2.2.2 植物螯合肽  31
      2.2.3 金属硫蛋白  31-32
  3 硫的代谢合成  32-34
    3.1 硫酸盐的吸收和转运  32-33
    3.2 硫酸盐的活化  33
    3.3 硫酸盐的还原  33
    3.4 Cys的合成  33-34
  4 本研究的目的和意义  34-37
第一章 水稻中对重金属胁迫响应的miRNA克隆与分析  37-64
  1 前言  37
  2 材料与方法  37-48
    2.1 试剂、材料培养与处理  37-40
      2.1.1 植物材料  37
      2.1.2 材料培养  37
      2.1.3 重金属胁迫处理  37-38
      2.1.4 水稻营养液(pH=5.5)  38
      2.1.5 缓冲液  38
      2.1.6 文库构建试剂  38-40
      2.1.7 表达所用引物  40
    2.2 水稻中受重金属胁迫响应的小分子RNA文库的构建  40-45
      2.2.1 小RNA提取  40-41
      2.2.2 小分子RNA加尾  41
      2.2.3 小分子RNA加尾产物加5’接头  41-42
      2.2.4 PCR富集cDNA文库  42-43
      2.2.5 PAGE胶中回收DNA  43
      2.2.6 目的片段与载体连接  43
      2.2.7 目的片段转化及鉴定  43-45
    2.3 生物信息学方法分析测序结果  45-47
      2.3.1 测序结果分析  45
      2.3.2 分析方法和途径  45-47
    2.4 miRNA与其靶基因的表达分析  47-48
  3 结果与讨论  48-61
    3.1 水稻中受重金属胁迫响应的小分子RNA文库的构建  48-49
    3.2 新发现的水稻miRNA特征  49-55
    3.3 克隆到的已知miRNA  55
    3.4 其它内源性非编码小RNA  55-56
    3.5 水稻中miRNA靶基因的预测  56-57
    3.6 新miRNA在重金属胁迫下的表达模式  57-59
    3.7 文库克隆到的已知miRNA在重金属胁迫下的表达模式  59-61
    3.8 靶基因的表达与分析  61
  4 讨论  61-64
第二章 油菜缺硫及镉调控的miRNA克隆与分析  64-78
  1 前言  64
  2 材料与方法  64-68
    2.1 材料与处理  64-65
      2.1.1 材料与培养  64
      2.1.2 材料处理  64-65
    2.2 直接克隆法分离和鉴定miRNA  65-66
      2.2.1 试剂与试剂盒  65-66
      2.2.2 miRNA克隆  66
      2.2.3 生物信息学方法分析测序结果  66
    2.3 油菜靶基因5’RACE分析切割位点  66-68
      2.3.1 油菜总RNA的提取  66
      2.3.2 总RNA定量与完整性检测  66-67
      2.3.3 RACE  67
      2.3.4 5’RACE接头的连接  67
      2.3.5 反转录  67
      2.3.6 5’RLM-RACE PCR  67-68
      2.3.7 5’RLM-RACE巢式PCR  68
      2.3.8 目的条带回收,转化,测序  68
    2.4 miRNA和其靶基因表达  68
  3 结果与分析  68-75
    3.1 文库测序结果与分析  68-69
    3.2 Bn-miR395靶基因的预测、克隆和功能分析  69-71
    3.3 RACE分析Bn-miR395的剪切位点  71-72
    3.4 Bn-miR395调控油菜缺硫与镉胁迫反应  72-73
    3.5 油菜miR395过表达植株  73-75
  4 讨论  75-78
第三章 miR395对缺硫胁迫反应的功能鉴定与分析  78-96
  1 前言  78-79
  2 材料与方法  79-88
    2.1 材料与试剂  79-81
      2.1.1 植物材料  79
      2.1.2 质粒及菌株  79
      2.1.3 材料培养  79
      2.1.4 GM培养基培养  79
      2.1.5 缺硫处理  79
      2.1.6 拟南芥GM培养基相关试剂  79-80
      2.1.7 转基因相关试剂  80
      2.1.8 载体构建相关试剂  80-81
      2.1.9 Northern相关试剂  81
    2.2 拟南芥miR395过表达载体的构建  81-83
      2.2.1 拟南芥总DNA的提取  81-82
      2.2.2 PCR扩增拟南芥miR395c、miR395e前体基因  82
      2.2.3 目的片段的回收  82
      2.2.4 目的片段与pMD19-T载体的连接  82
      2.2.5 转入大肠杆菌  82
      2.2.6 质粒的提取  82-83
      2.2.7 酶切目的片段  83
      2.2.8 目的片段链接至pBI121表达载体  83
    2.3 SULTR2;1_(PRO)::SULTR2;1:GFP和SULTR2;1_(PRO)::SULTR2;1_(mutant):GFP载体构建  83-84
      2.3.1 拟南芥总RNA的提取  83
      2.3.2 拟南芥cDNA模板合成  83
      2.3.3 PCR扩增拟南芥SULTR2;1基因和SULTR2;1启动子  83
      2.3.4 SULTR2;1基因与miR395的互补位点突变  83-84
      2.3.5 目的片段的回收  84
      2.3.6 目的片段与pMD19-T载体的连接  84
      2.3.7 转入大肠杆菌  84
      2.3.8 PCR扩增及质粒的提取  84
      2.3.9 目的片段链接至表达载体pBI101  84
    2.4 拟南芥转化  84-85
      2.4.1 转入农杆菌  84-85
      2.4.2 侵染  85
      2.4.3 卡那霉素筛选  85
    2.5 Northern方法与步骤  85-87
      2.5.1 总RNA提取  85
      2.5.2 RNA样品的制备  85
      2.5.3 电泳分离  85
      2.5.4 转膜  85-86
      2.5.5 探针的制备  86
      2.5.6 预杂交  86
      2.5.7 杂交  86-87
      2.5.8 洗膜  87
      2.5.9 曝光  87
      2.5.10 QPCR验证基因表达  87
    2.6 转基因植物GFP成像  87-88
  3 结果与分析  88-94
    3.1 拟南芥5种不同基因型的表型  88-89
    3.2 miR395表达模式  89-90
    3.3 miR395靶基因表达  90-92
    3.4 miR395调控SULTR2;1模式分析  92-94
  4 讨论  94-96
全文小结  96-98
创新点  98-100
存在问题和工作展望  100-102
参考文献  102-116
攻读学位期间发表的论文  116-118
致谢  118

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 油菜籽（芸薹）
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