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亚洲棉和陆地棉基因组BAC文库的构建及初步应用

作　者: 胡艳
导　师: 张天真
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物技术
关键词: 棉花 启动子 基因组文库 重叠群 BAC
分类号: Q943.2
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
下　载: 71次
引　用: 2次
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内容摘要


含有大片段基因组DNA的BAC文库是基因图位克隆、物理作图、基因组测序和新分子标记发掘的重要工具。为了对棉花基因组进行深入地研究,构建更多插入片段大、基因组覆盖率高的BAC文库是必不可少的。本研究在Zhang HB BAC文库构建方法的基础上,作了一些改进,建立了一套高效的棉花BAC文库构建技术体系,包括高分子量基因组DNA的提取、部分酶切最佳条件的确定、片段大小的选择、高效连接转化体系等。利用所建立的高效BAC文库构建技术体系,以pIndigoBAC-5为载体,分别选用亚洲棉(基因型A2A2)和陆地棉(基因型AADD)为材料构建了基因组BAC文库。这些新的BAC文库连同已经构建的棉花的BAC文库是棉花基因组研究的重要资源。所构建的亚洲棉品种江陵中棉BAC文库,共包括123,648个单克隆,保存于322块384孔培养板中。以亚洲棉基因组大小为1690Mb计算,此文库相当于7.2倍亚洲棉基因组大小。随机挑取103个单克隆,Not I酶切释放插入片段,电泳检测得到所插入片段范围为30-190 kb,平均为100.2 kb,空载率<1%。随机挑取6个BAC克隆进行稳定性测验,实验证明BAC克隆单个克隆可以在宿主大肠杆菌中稳定繁殖至少100代,不发生插入片段的丢失和酶切带型的改变。同时,为了便于通过PCR技术对文库进行筛选,还构建了该文库的混合池。混合池分为二级,一级为行池(Row Pool)和列池(Column Pool);二级为超级混合池。混合池的建立极大地方便了对文库的筛选。通过筛选江陵中棉BAC文库的方法,得到了含有GaMYB7基因的阳性单克隆,以此作为Tail-PCR的起始模板,获得的总长度1566bp的GaMYB7基因上游序列。经过序列分析确定了转录起始位点(Transcription Start Site,TSS)、TATA-box和CAAT-box。通过序列分析发现,该序列包含多个光调控元件,还具有生长素和赤霉素应答的基本结构。在此基础上,构建了3个5’端含不同应答元件的启动子片段驱动GUS基因的植物表达载体。通过基因枪转化棉花胚珠瞬时表达实验发现,三个启动子片段均能指导报告基因在棉花胚珠中正常表达。因此,GaMYB7启动子可用于研究棉花纤维的发育、品质改良以及外源基因在棉花纤维中的特异表达。所构建的陆地棉遗传标准系TM-1 BAC文库共有170.880个单克隆,保存于445块384孔中。随机挑取110单克隆,用Not I酶切,得到所插入片段范围为97-240 kb,平均插入片段为122.8 kb；空载率<1%；96%的克隆插入片段>100 kb。以陆地棉基因组大小为2425Mb计算,此文库相当于8.6的单倍棉花基因组大小。同样,为了便于通过PCR技术对文库进行筛选,构建了该文库的混合池。Column-Pool库保存于19块384孔板中,每孔由24个单克隆混合而成,标号为CP1-CP19。Super-pool保存于2块384孔板中,每孔由384(24×16)个单克隆混合,共456个。Giant-pool由Super-pool混合而成,共114个,每孔由1536(24×16×4)个单克隆混合而成。从此文库中筛选一个阳性单克隆大约需要158个PCR反应。陆地棉12号及26号染色体系部分同源染色体。目前一些重要的农艺性状基因已被定位在这两条染色体上。为了图位克隆这些重要的农艺性状相关的基因,需要构建这两条染色体的物理图谱。我们以遗传图谱上定位在这两条染色体上的分子标记进行BAC文库的筛选,筛选到的阳性单克隆总数为607个,平均为每个标记约4个克隆。各个标记筛到的阳性单克隆数从1到16个。12和26号染色体上共有的克隆共68个。有共同克隆的标记分为21组,49个标记。通过比较发现,这些筛选到相同克隆的标记一般在遗传图谱上的遗传距离也比较近,这也验证了遗传图谱的准确性。还有一些标记如NAU3294和NAU3293, BNL1673和NAU1463, NAU4095和NAU3905, NAU3441和NAU3442,分别位于不同的染色体上,但是也筛选到了共同的克隆,说明这一对引物所处的位置为同源染色体区段。这也证明了12和26号染色体部分同源。提取了全部380个阳性单克隆(从607个克隆中去除了一些重复的共同克隆)的质粒,进行HindⅢ酶切,获得了每个单克隆的酶切指纹图谱,通过Image3.10b和FPCV8.5软件的分析,初步构建了12和26号染色体的重叠群。

全文目录


目录  4-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
本文所用主要缩略词  12-14
第一部分 文献综述  14-38
  第一章 基因组文库研究进展  14-24
    1 Lambda噬菌体文库和Cosmid文库  14
    2 酵母人工染色体(YAC)  14-15
    3 细菌人工染色体(BAC)  15-20
      3.1 BAC文库载体的发展  15-17
      3.2 BAC文库的构建  17-18
      3.3 BAC文库的分类  18-19
      3.4 BAC文库的优点  19
      3.5 BAC文库的应用  19-20
    4 P1克隆系统和源于P1的人工染色体(PAC)  20
    5 双元细菌人工染色体(BIBAC)  20-22
    6 TAC文库  22
    7 各克隆系统之间的比较  22-24
  第二章 BAC文库在棉花基因组研究上的应用  24-36
    1 目前已构建的棉花BAC文库  24-26
    2 BAC与基因的图位克隆  26-29
      2.1 质量性状基因的图位克隆  26-27
      2.2 数量性状基因的图位克隆  27-29
    3 BAC与基因组物理图谱的构建  29-32
      3.1 棉花高密度分子遗传图谱的构建  30-31
      3.2 棉花的物理作图  31-32
    4 BAC-FISH技术的应用  32-33
    5 BAC与新的分子标记的开发  33-34
    6 BAC与比较基因组学  34-36
  本研究的目的和意义  36-38
第二部分 研究报告  38-133
  第三章 江陵中棉BAC文库的构建及棉纤维优势表达基因GaM-YB7启动子的克隆  38-78
    1 材料  39-41
    2 研究方法  41-56
      2.1 文库的构建  41-53
      2.2 BAC文库的应用——GaMYB7基因启动子的克隆  53-56
    3 结果与分析  56-72
      3.1 棉花HMW-DNA的提取  56-57
      3.2 最佳部分酶切酶浓度的确定  57-58
      3.3 酶切片段的第一次选择  58-59
      3.4 酶切片段的第二次选择  59-60
      3.5 电洗脱回收大片段DNA  60-61
      3.6 连接与转化  61
      3.7 单克隆的挑取与混合池的构建  61-62
      3.8 文库质量检测  62-65
      3.9 BAC文库的筛选结果  65-66
      3.10 TAIL-PCR结果  66-68
      3.11 顺式调控元件预测结果  68-71
      3.12 植物表达载体的构建  71
      3.13 瞬时表达分析  71-72
    4 讨论  72-78
      4.1 棉花基因组文库构建  72-74
      4.2 棉花基因组中NotⅠ酶切位点  74-75
      4.3 亚洲棉BAC文库的利用  75
      4.4 从BAC文库中克隆基因的优点  75-76
      4.5 组织特异性启动子的应用  76-78
  第四章 陆地棉遗传标准系TM-1 BAC文库及12和26部分同源染色体重叠群的构建  78-133
    1 材料  79-80
      1.1 文库构建材料  79
      1.2 标记的来源  79
      1.3 菌株和载体  79
      1.4 限制性内切酶  79-80
    2 实验方法  80-86
      2.1 TM-1 BAC文库的构建  80
      2.2 高密度遗传图谱的构建  80
      2.3 PCR法筛选BAC文库  80-86
      2.4 BAC克隆的纯化  86
      2.5 BAC克隆质粒提取  86
      2.6 酶切分析  86
      2.7 重叠群的构建  86
    3 结果与分析  86-128
      3.1 HMW-DNA的提取  86-87
      3.2 文库平均插入片段大小和空载率的检测  87-88
      3.3 单克隆的挑取和保存  88
      3.4 BAC文库筛选  88-116
      3.5 有共克隆的标记  116-121
      3.6 部分同源的BAC克隆  121-122
      3.7 BAC重叠群的构建  122-128
      3.8 利用阳性BAC进行基因克隆  128
    4 讨论  128-133
      4.1 基于PCR的BAC文库的筛选方法  128-129
      4.2 构建物理图谱的策略选择  129-131
      4.3 构建物理图谱的意义  131-133
全文结论  133-135
参考文献  135-145
附录1  145-151
攻读博士期间发表的学术论文  151-152
致谢  152

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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